人輪狀病毒抗體（RV Ab）ELISA試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

人輪狀病毒抗體（RV Ab）ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

檢測(cè)原理:試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人輪狀病毒抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中人輪狀病毒抗體（RVAb）的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法:

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品:

1.37℃恒溫箱

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.酶標(biāo)儀（450nm）

操作注意事項(xiàng):

1.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.預(yù)處理后的樣本請(qǐng)按照操作步驟用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋以達(dá)到試劑盒的的*檢測(cè)效果。

4.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

人輪狀病毒抗體（RV Ab）ELISA試劑盒組成:

1.名稱(chēng)96孔配置48孔配置備注

2.微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無(wú)

3.陰性對(duì)照0.5mL 0.5mL 無(wú)

4.陽(yáng)性對(duì)照0.5mL 0.5mL 無(wú)

5.檢測(cè)抗原-HRP 10mL 5mL 無(wú)

6.20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋

7.樣本稀釋液6mL 3mL 無(wú)

8.底物A 6mL 3mL 無(wú)

9.底物B 6mL 3mL 無(wú)

10.終止液6mL 3mL 無(wú)

11.封板膜2 張2 張無(wú)

12.說(shuō)明書(shū)1 份1 份無(wú)

13.自封袋1 個(gè)1 個(gè)無(wú)

試劑的準(zhǔn)備:20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20稀釋?zhuān)?份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法:

1.自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

操作步驟:

1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各50μL；

3.待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.隨后陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷:

1.試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。

2.臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

3.陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4.陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽(yáng)性

試劑盒性能:

1.準(zhǔn)確性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。

2.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

4.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

5.有效期：6個(gè)月