人?？刹《究贵w（ECHO-Ab）ELISA試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

人?？刹《究贵w（ECHO-Ab）ELISA試劑盒使用說明書

檢測原理:試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人?？刹《究乖陌晃⒖字?，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中人埃可病毒抗體（ECHO-Ab）的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法:

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品:

1.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

2.37℃恒溫箱

3.酶標儀（450nm）

操作注意事項:

1.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.預(yù)處理后的樣本請按照操作步驟用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋以達到試劑盒的的*檢測效果。

4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

人埃可病毒抗體（ECHO-Ab）ELISA試劑盒組成:

1.名稱96孔配置48孔配置備注

2.微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無

3.陰性對照0.5mL 0.5mL 無

4.陽性對照0.5mL 0.5mL 無

5.檢測抗原-HRP 10mL 5mL 無

6.20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋

7.樣本稀釋液6mL 3mL 無

8.底物A 6mL 3mL 無

9.底物B 6mL 3mL 無

10.終止液6mL 3mL 無

11.封板膜2 張2 張無

12.說明書1 份1 份

13.自封袋1 個1 個無

試劑的準備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法:

1.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

操作步驟:

1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；

3.待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷:

1.試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15。

2.臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3.陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4.陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性

試劑盒性能:

1.準確性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15，說明試驗結(jié)果有效。

2.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

4.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

5.有效期：6個月