人14-3-3蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒【試劑的準備和保存】
A. 人14-3-3蛋白標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準備。將凍干品管內(nèi)加入500ul樣品稀釋液，*溶解后取出250ul加入到750ul樣品稀釋液中，混勻后做倍比稀釋。
稀釋后的人14-3-3蛋白標準品在2小時內(nèi)使用。
B．*標記人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul*標記人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體加人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。
C．親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。
D. TMB工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備。取TMB顯色液A 9份加TMB顯色液B 1份，混勻后即為TMB工作液，切忌TMB工作液要避光保存，使用的過程中，避免接觸金屬器械。
人14-3-3蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒【操作程序】
1． 確定本次檢測所需的已包被人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體的酶標板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的人14-3-3蛋白標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標本按100ul每孔加入。
3． 酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。
4． 反應后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體；或甩去酶標板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準備好的*人14-3-3蛋白人14-3-3蛋白抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 每孔0.1ml依次加入TMB工作液，37℃避光反應，反應過程中，要經(jīng)常的觀察，當肉眼可見人14-3-3蛋白標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標儀在450nm測定O.D.值。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。
【注意事項】
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時，切記混勻！
3． 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
4． 建議所有人14-3-3蛋白標準品、樣本都做雙份檢測。
5． 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。
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