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PCRR實驗一般循環(huán)步驟
2024-12-23 閱讀(71)
PCR由變性——退火——延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
準備好各種試劑和PCR儀，就可以開始PCR實驗：將各種試劑混合并按照說明書設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)如下：
1、起始步驟：這對于熱啟動PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94~98℃以激活DNA聚合酶。這一步的時間取決于所選用的DNA聚合酶。
2、變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94～98℃保持20～30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3、退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因為反應(yīng)體系中的引物與DNA模板互補，當反應(yīng)溫度降至50~65℃時，引物與互補的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3～5℃。這一步通常維持20～40秒，而聚合酶會結(jié)合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。
4、延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的優(yōu)溫度。通常我們選用72℃，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68℃。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA。
5、循環(huán)：第2步至第4步稱為一個循環(huán)。每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進行30~35個循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。
6、最后的延伸步驟：當30~35個循環(huán)結(jié)束后，我們通常會以68~74℃延伸5~10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。
7、保存溫度：通常我們設(shè)置4~10℃為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。
每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動力學(xué)PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。
