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詳解PCR技術(shù)實驗原理

2022-10-24  閱讀(989)

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一項利用 DNA 雙鏈復制原理,在生物體外復制特定 DNA 片段的的核酸合成技術(shù)。可在短時間內(nèi)大量擴增目的 DNA 片段,而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。

DNA 的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在 DNA 聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn),DNA 在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制 DNA 的變性和復性,加入設(shè)計引物,DNA 聚合酶,dNTP 就可以完成特定基因的體外復制,這是 PCR 的理論基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成:
1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應做準備;

2、模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;
 3、引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

    重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍


   





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