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細(xì)胞培養(yǎng)之傳代復(fù)蘇凍存流程

2024-4-8  閱讀(326)

細(xì)胞培養(yǎng),既包括微生物細(xì)胞的培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞,這是克隆技術(shù)重要的環(huán)節(jié),細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來(lái),所以可以說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)方法:

1、細(xì)胞傳代:

細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代。

1、棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;

2、加入2ml0.25%T25瓶),使覆蓋整個(gè)瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;

31-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入全培養(yǎng)基終止消化;若細(xì)胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;

4、將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;

5、用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;

6、懸浮細(xì)胞直接離心收集,細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%T25瓶),使覆蓋整個(gè)瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;

1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入全培養(yǎng)基終止消化;若細(xì)胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇:

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時(shí)間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存:

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%T25瓶)

1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入全培養(yǎng)基終止消化;

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細(xì)胞;

④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。




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