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PCR反應引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域指南

2024-9-18  閱讀(340)

  PCR反應產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則:
 
  1、引物長度約為16-30 bp, 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。
 
  2、引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。
 
  3、四種堿基應隨機分布,在3'端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導致錯誤引發(fā)。
 
  4、引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。
 
  5、在引物內, 尤其在3'端應不存在二級結構。
 
  6、兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在 4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。
 
  7、引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物su、熒光素等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。
 
  8、引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結構, 以免產(chǎn)生非特異性擴增,影響產(chǎn)量。
 
  9、簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。
 
  10、一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計, 可精確計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算:
 
  X mol/L= OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
 
  X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T:引物中4種不同堿基個數(shù)。
 


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