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PCR檢測試劑盒?PCR反應引物設計原則

2025-2-17  閱讀(194)

PCR檢測試劑盒PCR反應引物設計原則:
PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。PCR檢測試劑盒PCR反應引物設計的基本原則如下:
(1)  引物長度:15-30 bp,常用為20 bp左右。
(2) 引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
(3) 引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。

(4)兩個引物之間不應存在互補序列,尤其是避免3 ′端的互補重疊。

(5) 引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有全互補序列,否則易導致非特異性擴增。

(6)引物3‘端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應嚴格要求配對,選擇是G和C。
(7) 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物su、熒光物質(zhì)、di 高辛標記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。




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