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癌基因轉(zhuǎn)化細胞基因組 DNA 轉(zhuǎn)染法實驗步驟

2021-6-17  閱讀(1080)

癌基因轉(zhuǎn)化細胞基因組 DNA 轉(zhuǎn)染法實驗步驟:

1、 提取基因DNA(含癌基因).

2、 DNA準備:取供體DNA50~100微克,加3M NaCl或醋酸鈉使最終濃度至0.3M混勻.

3、 再加2倍體積無水乙醇,3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,去上清.

4、 加入轉(zhuǎn)染緩沖液,待DNA充分融解后,再加入2.5M CaCl2,令最終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次.置室溫下10~30分鐘,待液體透明度降低,出現(xiàn)微濁藍色時,即可用于轉(zhuǎn)染受體細胞.

5、 細胞:取生長狀態(tài)良好、處于半?yún)R合階段的指數(shù)增生期細胞,在轉(zhuǎn)染前24小時,更換培養(yǎng)液1次.

6、 轉(zhuǎn)染:向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5~1ml/瓶,置37℃作用4~6小時.

7、 培養(yǎng):棄去培養(yǎng)液,用15%甘油處理3分鐘,無血清培養(yǎng)漂洗1次,加入新培養(yǎng)液,37℃溫箱培養(yǎng)24小時.

8、 傳代:按1:5或1:10分瓶傳代,每2~3天換液1次,接近匯合時血清用量降至5%,培養(yǎng)2~3周.

9、 檢測:逐日觀察,待出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶后,分離入另瓶中培養(yǎng). 



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