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海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)試劑盒

海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用

海藻糖-6 磷酸合成酶（TPS）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6550F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 海藻糖-6磷酸合成酶（TPS，EC 2.4.1.15）是海藻糖合成的關(guān)鍵酶之一，催化UDP- 葡萄糖和葡萄糖-6磷酸生成海藻糖-6磷酸和UDP。UDP與磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激 酶和乳酸脫氫酶的逐一作用下，使NADH氧化為NAD+，通過(guò)檢測(cè)NADH在340nm處的 下降量來(lái)計(jì)算TPS的酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 0.9mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 32mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 分別加 0.55mL 蒸餾水溶解備用。用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱/金 屬浴、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、海藻糖-6磷酸合成酶（TPS）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌或真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬(wàn)細(xì)菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），室溫晃動(dòng)提取 30min， 8000rpm 室溫（25℃）離心 10min，取上清。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液體積(mL) ：細(xì)菌或真菌數(shù)量（104個(gè)）為 1：500~1000 的比例提取 2、上機(jī)檢測(cè)： 1 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 60 60本試劑盒僅供科研使用 2 試劑一 30 試劑二 210 240 混勻，35℃孵育 30min 后，立即于 95-100℃煮沸 5min， 10000rpm，4℃離心 5min，上清液待測(cè)。 4 在 1mL 石英比色皿中依次加入： 試劑二 400 400 試劑三 40 40 試劑四 40 40 試劑五 20 20 ③的上清液 200 200 混勻，35℃下立即于 340nm 處讀取各管吸光值 A1， 30min 后讀取 A2?！?/span>A=(A1-A2)測(cè)定-(A1-A2)對(duì)照。 【注】 1.若△A 的值在零附近，可以適當(dāng)延長(zhǎng)③歩的反應(yīng)時(shí)間到 60min 后或更長(zhǎng)，改變后的反 應(yīng)時(shí)間需代入計(jì)算公式重新計(jì)算?；蜻m當(dāng)加大樣本量（如 100μL，則試劑二相應(yīng)減少）， 則改變后的加樣體積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若起始值 A1 太大如超過(guò) 2（如顏色較深的樣本）或ΔA 的值大于 0.4，可以適當(dāng)減少 ③的上清液加樣量 V3（如減少至 100μL，則試劑二相應(yīng)增加），則改變后的加樣體 積 V2 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 TPS 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V4÷（ε×d）×109] ×(V2÷V3) ÷(V1÷Cpr) ÷T =93.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算 單位定義：每克組織在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 TPS 活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V4÷（ε×d）×109] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =93.8×ΔA÷W 3、按細(xì)菌或真菌數(shù)量計(jì)算： TPS 活力(μg/104cell)= [ΔA×V4÷（ε×d）×109]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T =0.188×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.06mL； V2---第③歩的反應(yīng)總體積，0.3mL； V3---第④歩中所取上清液體積，0.2mL； V4---反應(yīng)體系總體積，7×10-4 L； d---光徑，1cm； ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或真菌總數(shù)，500 萬(wàn)； T---反應(yīng)時(shí)間，30min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。