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錳過(guò)氧化物酶(Mnp)試劑盒,微板法

錳過(guò)氧化物酶(Mnp)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 錳過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS4001W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 錳過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.13，Mnp）是真菌分泌的一種糖基化的胞外蛋白，含亞鐵血紅 素的過(guò)氧化物酶，主要存在于引起白腐的木腐菌和土壤枯草菌這兩個(gè)擔(dān)子真菌中，屬于木 質(zhì)素降解酶系，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和環(huán)境中其他一些抗性物質(zhì)，如腐殖質(zhì)酸和包 括多環(huán)芳烴在內(nèi)的多種有機(jī)污染物等。 錳過(guò)氧化物酶（Mnp）在 Mn2+存在的條件下，將二甲氧基*酚（DMP）氧化生成的產(chǎn)物 在 470nm 處有特征吸收峰。通過(guò)檢測(cè)該產(chǎn)物在 470nm 處的增加速率，即可得到 Mnp 酶活 性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 2.4mL 無(wú)水乙醇溶解備用。 試劑三 粉劑×1 支 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.5mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體×1 支 4℃保存 用前甩幾下使液體落入底部，取出 2µL 液體至新的 EP 管中，再加 1mL 蒸餾水混勻備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、天平、低溫離心機(jī)、研缽、冰和蒸餾水。 四、錳過(guò)氧化物酶（ Mnp)活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照數(shù)量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測(cè)，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min，取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 470nm。 2 所有試劑至常溫狀態(tài)（25℃）。 3 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（µL） 測(cè)定管 樣本 20 試劑一 145 試劑二 20 試劑三 10 試劑四 5 混勻，30℃條件下反應(yīng)，10s 時(shí)于 470nm 處讀取 A1，10min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】若△A 在零附近徘徊，可增加樣本量（如增至 40µL，則試劑一相應(yīng)減少），或延長(zhǎng)反應(yīng) 時(shí)間 T 至 15min 或更長(zhǎng)，則改變后的樣本 V1 和反應(yīng)時(shí)間 T 需代入公司重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1．按照蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個(gè)酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=36.4×ΔA÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個(gè)酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=36.4×ΔA÷W 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個(gè)酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V)÷T =36.4×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量 4．按照液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量為一個(gè)酶活力單位。 MnP 活性(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=36.4×ΔA ε---DMP 被氧化的產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)：55000L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---反應(yīng)中樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)總體積，2×10-4 L； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，10min Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。