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GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)試劑盒,微板法

GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書 （貨號(hào)：WS3011W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T，EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的關(guān)鍵酶之一，催化 GABA 的降解和轉(zhuǎn)化。 本試劑盒利用γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）催化丙酮酸和 GABA 反應(yīng)生成生成琥 珀酸半醛和丙*酸，通過(guò)檢測(cè) GABA 的減少量進(jìn)而得出 GABA-T 酶活力大小。 反應(yīng)方程式：4-aminobutanoate + pyruvate = succinate semialdehyde + L-alanine 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 3mL 試劑三溶解備用。 試劑二 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 4.5mL 試劑三溶解備用。 試劑三 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 11mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 8mL×3 瓶 B：液體 2mL×1 支 4℃保存 臨用前取0.55mL的B液進(jìn)一瓶A 液中，混勻后作為試劑六使用。 混勻后的試劑六半個(gè)月內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣本情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 2、 上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 645nm。 ② 所有試劑解凍至室溫，在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 40 40 試劑一 40 蒸餾水 40 試劑二 40 40 混勻，于 30℃孵育 30min 試劑四 80 80 立即混勻，室溫 12000rpm，離心 5min，上清液待測(cè)本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應(yīng)：于 EP 管中依次加入： 上清液 50 50 試劑四 30 30 試劑五 100 100 試劑六 200 200 混勻，沸水浴（95-100℃）10min，冰浴至室溫，呈現(xiàn)藍(lán)綠色顏 色，若渾濁需 12000rpm 離心 5min，取澄清的 200μL 至 96 孔板 中，于 645nm 處讀取各管的 A 值，△A=A 對(duì)照-A 測(cè)定(每個(gè)樣本 需做一個(gè)自身對(duì)照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加樣本質(zhì)量 W（如增至 0.2g），或延長(zhǎng) 30℃孵育時(shí)間 T（如增至 1h 或更長(zhǎng)），或加大樣本量 V1（如增至 80μL，則試劑四相應(yīng)減少），則改變后的 W 和 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.508x - 0.0003，x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(mg/mL)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)消耗 1mg 的 GABA 定義為一個(gè)酶活力單位。 GABA-T (mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(V1×Cpr)÷T=19.7×(ΔA+0.0003)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每小時(shí)消耗 1mg 的 GABA 定義為一個(gè)酶活力單位。 GABA-T (mg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(W×V1÷V)÷T =19.7×(ΔA+0.0003)÷W 4、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)消耗 1mg 的 GABA 定義為一個(gè)酶活單位。 GABA-T (mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(500×V1÷V)÷T =0.04×(ΔA+0.0003) 5、按照液體體積計(jì)算: 單位定義：每毫升液體每小時(shí)消耗 1mg 的 GABA 定義為一個(gè)酶活力單位。 GABA-T(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷V1÷T=19.7×(ΔA+0.0003) V---提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； V2---反應(yīng)體系總體積：0.2mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30min=0.5h； W---樣本質(zhì)量，g； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（2mg/ml）：標(biāo)準(zhǔn)品臨用前加 1mL 蒸餾水溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml。也可根據(jù)實(shí) 際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照顯色反應(yīng)階段的測(cè)定管加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。