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芳基酰胺酶活性測定試劑盒,微板法

芳基酰胺酶活性測定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 芳基酰胺酶活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS3340W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 芳基酰胺酶(aryl-acylamidase) (EC 3. 5. 1.3)，廣泛存在于動物、植物、微生物中，可水 解帶有酰胺基團(tuán)的化合物，是生物體內(nèi)農(nóng)藥及其他外源物質(zhì)的重要水解酶之一。 本試劑盒采用芳基酰胺酶水解底物產(chǎn)生對硝基苯胺，在波長 405nm 處有吸收峰， 通過檢測生成的產(chǎn)物對硝基苯胺在 405nm 處的增長速率即可得出該酶活性大小。 二、測試盒組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、乙醇、冰和蒸餾水。 四、芳基酰胺酶活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑 一，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 15min，取 上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 405nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 為了減少操作誤差，建議使用排槍。 ④ 依次在 96 孔板中加入： 【注】1. 加完試劑二即啟動反應(yīng)，所以試劑二加完混勻后立即檢測，若 A2 值大于 1.5，可對樣本進(jìn)行稀 釋，稀釋倍數(shù)需代入公式重新計算。 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 液體 125mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 4mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若要重新做標(biāo)曲則用到該試劑。 試劑名稱（μL） 測定管 試劑一 120 樣本 40 試劑二 40 混勻，立即于 405nm 處讀取 A1 值，37℃反應(yīng) 30min 后讀取 A2 值。ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 2 2. 若ΔA小于0.005，可增大樣本量V1（如增至80μL，試劑一相應(yīng)減少），則改變后的V1需代入公 式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0279x - 0.009：x 為標(biāo)準(zhǔn)品(nmoL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：在 37℃，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 標(biāo)準(zhǔn)品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(W×V1÷V)÷T =29.87×(ΔA+0.009)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：在37℃，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmoL標(biāo)準(zhǔn)品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mg prot)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(V1×Cpr)÷T=29.87×(ΔA+0.009)÷Cpr 4、按細(xì)胞數(shù)量計算： 酶活定義：在 37℃，每 104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 標(biāo)準(zhǔn)品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/104 cell)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷(500×V1÷V)÷T=0.06×(ΔA+0.009) 5、按照液體體積計算： 單位定義：在 37℃，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1nmoL 標(biāo)準(zhǔn)品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mL)= [(ΔA+0.009)÷0.0279]÷V1÷T=29.87×(ΔA+0.009) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； T---反應(yīng)時間，30min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，加入 0.1mL 乙醇，渦旋震蕩溶解后再加入 0.9mL 的蒸餾水混勻，得到 10μmol/mL 備用。 2 用蒸餾水把母液稀釋成以下濃度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際來 調(diào)整濃度。 3 40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+160μL 試劑一，混勻后于 405nm 處讀取 A 值，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn) 曲線。