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肌酸激酶(CK)試劑盒,微板法

肌酸激酶(CK)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào):WS5580W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 肌酸激酶（CK，EC 2.7.3.2）主要存在于心臟、肌肉及腦等組織中，能可逆地催化 肌酸與 ATP 之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)，在能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和 ATP 再生中有重要作用。 CK 催化磷酸肌酸和 ADP 生成肌酸和 ATP，通過(guò)添加的己糖激酶與 6-磷酸葡萄糖 脫氫酶復(fù)合體，依次催化 ATP 的水解與并伴隨著 NADPH 的生成，通過(guò)檢測(cè) NADPH 在 340nm 處吸光值的增加即可得出 CK 酶活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑二 粉劑×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑三 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×4 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 每支加 0.3mL 蒸餾水充分溶解。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板天平、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、恒溫培養(yǎng)箱、研缽。 四、肌酸激酶（CK）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移至 EP 管中，12000rpm, 4℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液(mL)為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，設(shè)定溫度至 37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 ② 所有試劑可預(yù)先在 37℃條件下預(yù)溫 5min，在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1.若 A 測(cè)定大于 1.5，則可減少反應(yīng)時(shí)間 T（如減至 10min）再讀取 A2，或減少樣本加樣量 V1 （如減至 5μL, 則試劑三相應(yīng)增加）,則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若△A 的值小于 0.01，則可增大樣本體積 V1（如增至 80μL 或更多，則試劑三相應(yīng)減少），或 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 30min 或更長(zhǎng)），則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按組織蛋白含量計(jì)算： 定義：37℃條件下，每毫克蛋白質(zhì)在每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoL NADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=214.4×ΔA÷Cpr 2、按組織樣本質(zhì)量計(jì)算： 定義：37℃條件下，每克樣品在每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1÷V×W)÷T=214.4×ΔA÷W 3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 定義：37℃條件下，每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.43×ΔA 4、按液體體積計(jì)算： 定義：37℃條件下，每毫升液體在每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=214.4×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/moL/cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，15min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。 37℃條件下孵育 20min， 試劑四 10 混勻，37℃條件下，立即于 340nm 處讀取 A1，15min 后讀取 A2，△A= A2-A1。