溶液和試劑

裂解緩沖液

這些緩沖液可在 4 ℃ 下保存數(shù)周，或者以分裝形式在 -20 ℃ 下保存長達 1 年。

Nonidet-P40 (NP40) 緩沖液

150 mM NaCl

1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）

50 mM Tris-HCl pH 8.0

蛋白酶抑制劑（一定要添加，推薦 cocktail 形式的，貨號 A10004）

RIPA 緩沖液（放射免疫沉淀試驗緩沖液）

150 mM NaCl

1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100

0.5% 脫氧膽酸鈉

0.1% SDS（十二烷基硫酸鈉）

50 mM Tris-HCl pH 8.0

蛋白酶抑制劑（一定要添加，推薦 cocktail 形式的，貨號 A10004）

Tris-HCl 緩沖液

20 mM Tris-HCl pH 7.5

蛋白酶抑制劑（一定要添加，推薦 cocktail 形式的，貨號 A10004）

電泳、轉膜、封閉緩沖液

Laemmli 2×緩沖液/上樣緩沖液

4% SDS

20% 甘油

0.004% 溴酚藍

0.125 M Tris-HCl

測定 pH 并調節(jié)至 pH 6.8。

電泳緩沖液（Tris-ganansuan/SDS）

25 mM Tris 堿

190 mMganansuan

0.1% SDS

測定 pH，pH 應為約 8.3。必要時進行調節(jié)。

轉膜緩沖液（濕轉）

25 mM Tris 堿

190 mM ganansuan

20% 甲醇

測定 pH，pH 應為約 8.3。必要時進行調節(jié)。

對于大于 80 kDa 的蛋白質，推薦加入最終濃度為 0.1% 的 SDS。

轉膜緩沖液（半干轉）

48 mM Tris

39 mMganansuan

20% 甲醇

0.04% SDS

封閉緩沖液

5% 奶粉（推薦使用，也可以用 BSA 牛血清白蛋白）

加入 TBST 緩沖液中?；靹虿⑦^濾。過濾失敗可能導致出現(xiàn)“斑點"，其中微小的黑色顆粒

會在顯色過程中污染印跡。

實驗步驟

A. 制備細胞裂解物

1. 吸干培養(yǎng)基。添加含有調節(jié)分子的新鮮培養(yǎng)基，使其在預定的時間內對細胞進行處理。

2. 收集細胞，去除培養(yǎng)基后用冰預冷的 1X PBS 洗滌細胞一次。

3. 去除 PBS，并在并在細胞培養(yǎng)容器中加入適量的已經添加了 Cock tail 蛋白酶抑制劑的

Lysis buffer。每 107 個細胞加入 1ml 冰預冷的 Lysis buffe（相當于 100mm 的培養(yǎng)皿，150cm2

的培養(yǎng)瓶），并在冰上孵育至少 5 分鐘。

4. 從板上刮下細胞，把提取物轉移至微量離心管。置于冰上。

5. 在冰上進行 3 次超聲破碎，每次 5 秒。如果沒有超聲儀，請用帶注射器的針頭(20G-18G-

16G)冰上反復抽吸，直到裂解液澄清；

6. 在 4°C，在 14,000 x g 條件下，微量離心 10 分鐘，將上清轉移到新管中。上清液即為細胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

注：細胞裂解物制備好之后，可先進行蛋白免疫印跡法檢測，以此來確定細胞裂解物里存在

目標蛋白。

B. 抗原抗體結合

1. 在新的離心管內加入 500μl（含總蛋白 200-1000ug）細胞裂解物。

2. 加入目標蛋白的單克隆/多克隆抗體（1-10μg，根據(jù)抗體使用說明書）。

3. 同時采用非特異免疫的同源抗體作為對照。

4. 在 4℃輕柔混合過夜。

C. 免疫復合物沉淀

1. 抗體孵育過夜后，加入 20μl Protein A/G。

2. 在 4℃溫和地混勻 1-3 小時或過夜。

3. 12000g 離心 1min，保留沉淀。

4. 使用 0.5ml 1*Wash buffer 清洗沉淀，12000g 離心 1min，保留沉淀。

5. 重復第 4 步，共計清洗 3 次。

注：清洗，去上清的時候需要注意避免吸走填料

D. 用蛋白免疫印跡法進行分析

1. 在 20-50 μl 1* SDS 樣品緩沖液中重懸沉淀物。渦旋振蕩，然后再微量離心 30 秒。

2. 將樣品加熱至 95–100°C 并持續(xù) 2-5 分鐘，然后在 14,000 x g 下瞬時離心 1 分鐘。

3. 將樣品 (15-30 μl) 上樣到 SDS-PAGE 凝膠上。

4. 用蛋白質印跡法分析樣品。

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