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初級(jí)會(huì)員 | 第6年

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?PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)分析

時(shí)間:2023/11/20閱讀:42
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循環(huán)參數(shù):

1.預(yù)變性

模板DNA全變性與PCR酶的全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要,建議加熱時(shí)間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.變性步驟

循環(huán)中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列全變性,可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性,過短靶序列變性不全,易造成擴(kuò)增失敗。

3.引物退火

退火溫度需要從多方面去決定,一般根據(jù)引物的Tm值為參考,根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶最適溫度)。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí),本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定,一般推薦在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。

5.循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-35循環(huán),過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

循環(huán)次數(shù) :一般為25 ~ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后,DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期"

6.最后延伸

在最后一個(gè)循環(huán)后,反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘.使引物延伸完,并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。


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