實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(real-time PCR)也叫qPCR(Quantitave PCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它是一項(xiàng)臨床上非常成熟的技術(shù)，目前在分子生物學(xué)領(lǐng)域，qPCR核酸定量好方法。
1、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號(hào)的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時(shí)采集，探針法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
e) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過多的背景信號(hào)。
2、Ct值出現(xiàn)過晚
1、 擴(kuò)增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)引物。
2、 模板濃度太低：減少稀釋度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3、 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
4、PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計(jì)為100 bp-200 bp之間。
5、反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時(shí)帶入，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3、陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增
1、 反應(yīng)體系組分(如水)被污染：實(shí)驗(yàn)過程中，更換新的Mix或者水重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
2、 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
3、 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
4、引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。
5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴(kuò)增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進(jìn)入60℃退火和延伸步驟)有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位于100 bp以下。
6、擴(kuò)增效率低
a) 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
c) 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
7、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差
a) 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍，擴(kuò)大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻。
