Exonuclease III

描述： 核酸外切酶 III 來源于 E.coli，具有 3′-5′外切酶活性，它作用于雙鏈 DNA，從 3′ OH 末端方向逐步切去單核苷酸；每次酶與底物結(jié)合催化，只有幾個(gè)核苷酸被除掉，從而在 DNA 分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進(jìn)缺失。該酶的底物為平末端、5′突出末端雙鏈 DNA 分子，但也可作用于雙鏈 DNA 的缺刻處，從 3′降解 DNA 分子，釋放 5′單核苷酸。對(duì)于 3′突出末端，尤其是多于 4nt 的幾乎不切割, 亦不能切割硫代磷酰脂鍵。核酸外切酶 III 的活性部分依賴螺旋結(jié)構(gòu)，并根據(jù)序列的不同 而有差異（C＞A=T＞G）。另外，核酸外切酶 III 還具有脫嘌呤/嘧啶-核酸內(nèi)切酶活性、RnaseH 活性和 3′磷酸酶活性。

活性定義：50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 條件下，30 分鐘
催化 E.coli DNA 產(chǎn)生 1 nmol 酸可溶性產(chǎn)物所需要的量定義為一個(gè)活性單位。
應(yīng)用： 非定向巢式缺失定點(diǎn)突變鏈特異性探針的制備
制備用于雙脫氧測(cè)序的單鏈底模板
熱失活：70°C，20min。
1X Exonuclease III Buffer: 10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10
mM MgCl2，1 mM DTT。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM
DTT, 25% Glycerol.
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復(fù)凍融。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。