SUMO 蛋白酶

也稱為 UIP 蛋白酶（分子量 26kD），是一種具有較高活性的半胱氨蛋白酶。SUMO 蛋白酶以一種非常特異的方式切割蛋白，它特異性識別 UBL 蛋白的三級結構－SUMO，而不是氨基酸序列，故該蛋白酶可以切割重組融合蛋白的 SUMO。切割的溫度為 30°C，該酶作用溫度和 PH 范圍（pH7-9）都比較廣泛。酶切后，可通過Ni-NTA Resin 親和純化很容易地將 SUMO 去除。該 SUMO蛋白酶是自 E.coli 表達經親和純化的重組蛋白酶，含有 His標簽。

活性定義：在 1XSUMO Protease Buffer (50 mM Tris-HCl,pH 8.0, 0.2% Igepal, 1 mM DTT)中，30°C 反應 1h，剪切>85％的 100pmol 底物，所需要的酶量定義為一個活性單位。
儲存：SUMO 蛋白酶置于-20°C 可保存 2 年。

2. 混勻上述體系后于 30°C 孵育 1-16 小時。若蛋白為熱不穩(wěn)定性，請在 4°C 孵育較長時間或增加酶用量。
3. 取樣品進行 SDS-PAGE 分析。
注意事項
為達到好的酶切效果，請保證重組蛋白為部分純化的蛋白。對于大部分融合蛋白，SUMO 蛋白酶所需 NaCl 的濃度不同的蛋白情況會有所差別，可根據實際情況在0～300mM 之間調節(jié) NaCl 的濃度以達到的效果。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。