5min極速RNA提取試劑盒

本試劑盒采用的裂解液，可快速可靠的從細(xì)胞、動物組織、植物組織、病毒液樣本、抗凝全血、培養(yǎng)細(xì)菌中純化出高純度的總 RNA。該試劑盒是目前國際上操作步驟最少、用時最短的 RNA 提取試劑盒（ 5 分鐘）。應(yīng)用本試劑盒提取的 RNA 可直接用于反轉(zhuǎn)錄、基因克隆、定量檢測、文庫構(gòu)建、雜交等多種分子生物學(xué)實驗。
注意事項：
(1) 本試劑盒中的 Washing Buffer 中已經(jīng)加乙醇，無需單獨(dú)添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蝕性，注意防護(hù)。操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中處理）培養(yǎng)細(xì)胞：消化完畢后，離心收集細(xì)胞沉淀，用 20~30μl 水或PBS 重懸細(xì)胞沉淀（務(wù)必重懸充分）。加入 120μl RNA LB1 漩渦混勻 30s(有未溶解的細(xì)胞團(tuán)塊，用槍頭吹打，助溶解)，加入 500μlRNA BB2 上下顛倒混合均勻，倒入吸附柱中。13000rpm 離心 30s，倒掉廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
組織樣品----采用研缽進(jìn)行研磨：用液氮研磨粉碎組織樣本，將研磨粉碎的樣品加入到 200μl RNA LB1 中，漩渦混合均勻 1min（有塊狀組織未溶解的，要使用槍頭吹打，助消化），加入 500μl RNABB2 上下顛倒混合均勻，13000rpm 離心 15s。將上清倒入吸附柱中（動作需輕柔，勿將未消化的組織塊倒入吸附柱），13000rpm 離心 30s，倒掉廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
組織樣品----采用鋼珠進(jìn)行研磨：將組織樣品加入到 300μl RNALB1 中（1.5ml EP 管），并加入幾粒鋼珠，置于組織研磨儀中，研磨 1~2min。向研磨后的勻漿液中加入 750μl RNA BB2，漩渦混勻5s，13000rpm 離心 1min。用 1ml 吸頭吸取 750μl 上清液到吸附柱中。13000rpm 離心 30s，倒掉廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。注意：植物組織的勻漿效果通常較動物組織差一些，所以一般推薦采用液氮條件下研缽來研磨。在采用鋼珠研磨的條件下務(wù)必將組織研磨粉碎，否則會導(dǎo)致產(chǎn)率降低。病毒液 /體液 /血清 /血漿：吸取 150μl 病毒液/體液樣品到加入到120μl RNA LB1 中，漩渦混合均勻 30s。直接加入 500μl RNA BB2中，漩渦混合均勻 15s。倒入吸附柱中，13000rpm 離心 30s，倒掉廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
培養(yǎng)細(xì)菌：收集菌體后，用 20~30μl 水重懸菌體（務(wù)必重懸充分），加入 120μl RNA LB1 漩渦混勻 30s，加入 500μl RNA BB2 上下顛倒混合均勻，倒入吸附柱中。13000rpm 離心 30s，倒掉廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
（2） 洗滌和洗脫
向吸附柱中加入 500μl Washing Buffer，13000rpm 離心 15s。重復(fù)此步驟一次。 將吸附柱重新放回離心機(jī)，13000rpm 空離心1min，將殘留的乙醇甩干。 將吸附柱芯放入到 2mL NucleaseFree 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50μl Nuclease Free H2O，室溫放置 1min，13,000rpm 離心 1min，洗脫液即為提取的 RNA，冷凍保存。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。