HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)

末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）是一種不依賴于模板的 DNA 聚 合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到 DNA 分子的 3’羥基端。帶有 突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈 DNA 分子均可作為 TdT 的 底物，加尾長度可達(dá) 5~300nt。本酶經(jīng)電子重構(gòu)架技術(shù)篩選， 使其可以在 45°C 高溫下反應(yīng)，從而避免因 DNA 二級結(jié)構(gòu)造 成的加尾效率下降。 該酶廣泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修飾堿 基（如 ddNTP，DIGdUTP）標(biāo)記 DNA 3’末端、TdT 介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記技術(shù)（細(xì)胞凋亡的原位檢測）等試驗(yàn)。

活性定義：37 ℃ 60 分鐘內(nèi)，催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羥基末端中所需的酶量定義為 1 個(gè)活性單位
熱失活：75°C 20min。
儲存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事項(xiàng)
1、適量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性喪失。
2、金屬離子螯合劑，較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 數(shù)的計(jì)算，長度為 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

本試劑采用穩(wěn)定高效的 RT-PCR 預(yù)混體系，是以 RNA 為模板進(jìn)行一步法 RT-PCR 的專用試劑。其原理為用基因特 異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得鏈 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成鏈 cDNA），再使 用基因特異性正向引物和反向引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在同一 反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到 PCR 的全部過程。反應(yīng)體 系中已含有電泳所需的指試劑（藍(lán)色和黃色），反應(yīng)后可以 直接進(jìn)行電泳。 在本試劑盒中，將耐熱 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 預(yù)混液；反應(yīng) Buffer、dNTP 以及 電泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此 使得操作更加簡單便，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于平端克隆和 DNA 測 序。
主要優(yōu)勢：
? 耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶可在55℃反應(yīng)能更好的打開復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)，只需 10min 即可完成逆轉(zhuǎn)錄。
? DNA 聚合酶為熱啟動型高保真酶，能夠有效的抑制非特異性反應(yīng)且具有較高的校正活性，酶激活僅需 2min。
? 具有寬泛的模板量兼容性，10 ng~1μg 都可有效擴(kuò)增。
? 反應(yīng)過程中無需開蓋，避免了操作過程中的污染危害。
組分
名稱 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
儲存：請置于-20°C，可保存 2 年；避免反復(fù)凍融。
注意：
1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高，次使用之前要離心收集至反應(yīng)管底部，吸取時(shí)應(yīng)緩慢小心。
2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶，反應(yīng)配制可在常溫進(jìn)行，但各組分應(yīng)-20°C 保存。
實(shí)驗(yàn)操作和反應(yīng)條件：
1. 按以下組分配制反應(yīng)液
RNA（病毒 DNA/RNA 樣品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
基因特異性上游引物（10μM） 0.8 μl
基因特異性下游引物（10μM） 0.8 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
注意：超過 1 μg 的 RNA 模板量會抑制 PCR 反應(yīng)，建議次可使用 200 ng 的 RNA 模板，然后根據(jù)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。
2. 在 PCR 儀上按以下條件進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng):
55°C， 10min 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
95°C， 2min 失活 M-MLV，并激活高保真聚合酶
95°C， 20s 30~40 cycles
TM°C， 20s
72°C ，
2Kb/min
72°C， 2min 末端延伸
3. PCR 反應(yīng)結(jié)束后，可取 5 μl 產(chǎn)物直接進(jìn)行電泳檢測。預(yù)混液中已經(jīng)包含綠色染料，無需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 電泳時(shí)，藍(lán)色指示劑指示 3~5 kb，黃色指示劑指示<50 bp。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。