Bst 4.0 SYBR Green Bead

該制品為全體系凍干微球制品，內(nèi)含恒溫擴增所用的反應(yīng)緩沖液、SYBR Green 熒光染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉(zhuǎn)錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及RT-LAMP 擴增反應(yīng)的試劑。
SYBR Green 系列產(chǎn)品為實時熒光檢測的專用試劑，可直接在恒溫?zé)晒鈨x或定量 PCR 以上進行 LAMP 反應(yīng)擴增。
儲存：-20℃保存 2 年；室溫（25℃）保存>6 個月。
使用凍干微球進行全擴增體系用品的制備方法：將優(yōu)化的擴增引物分裝于 0.2 ml EP 管底部，于 70-80℃條件烘干1-2h。烘干后的 0.2 ml EP 管已經(jīng)含有干燥的擴增引物，再加入一粒凍干微球即可制備成全擴增體系干燥品，該干燥品無需冷鏈運輸，可長期保存。
反應(yīng)體系說明：每一個凍干微球為按照 25 μl 反應(yīng)體系建立，在使用時只需要加入 25 μl 的 ddH2O 或模板即可進行反應(yīng)。
使用實例，進行 LAMP 熒光擴增
1. 配制熒光 LAMP 反應(yīng)體系在 0.2 ml EP 反應(yīng)管中加入下述試劑
Bst 4.0 SG Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到液體總量 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4-8 μM、F3/B3 分別為 2 μM。
2. 反應(yīng)體系配好后，置于熒光定量 PCR 儀中于 65°C進行反應(yīng) 15~30min。1min 收集一次熒光信號。讀取擴增曲線進行陰性和陽性判讀。
3. 根據(jù)熒光擴增曲線判讀陽性和陰性。
注意事項：
（1）關(guān)于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應(yīng)體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)液上部，可以有效的減少氣溶膠的污染。實驗證明礦物油并不影響機器的熒光數(shù)值讀取。
（2）關(guān)于擴增曲線的異常：由于 LAMP 擴增速度較快，熒光信號讀取可能存在矯正計算問題，這與熒光設(shè)備的軟件算法有管。在有些熒光 PCR 儀上，在相對熒光模式下，表現(xiàn)出曲線飛峰、終點曲線下降的問題。此時調(diào)整到原始熒光值模式下觀察結(jié)果，或致電相應(yīng)設(shè)備供應(yīng)商進行咨詢。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。