pBM28 Toposmart 克隆試劑盒

保存條件：-20℃保存。
產(chǎn)品介紹：
利用痘苗病毒的拓撲異構(gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將PCR產(chǎn)物定向克隆到線性化的pBM28載體中。適用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5 等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物。pBM28 載體類似于公司的pENTR/D-TOPO入門載體， 具有attL1 和attL2，為gateway系統(tǒng)中的入門載體。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和測序鑒定。
產(chǎn)品特點：
（1）連接反應僅需 5 分鐘。
（2）只適合平末端 PCR 產(chǎn)物的快速、高效、定向克隆。
（3）載體采用了新的制備工藝，零背景，無需藍白斑篩選。
（4）與pBM27載體相比，pBM28載體無標簽序列。
（5）載體為壯觀霉su抗性。
注意事項：
（1）引物要求：PCR 引物5’端不能進行磷酸化修飾，普通商業(yè)化引物即可。上游引物的5’ 端添加CACC 四個堿基（CACC 為真核表達所必需的Kozak 序列）。
（2）DNA 聚合酶：選用Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和Xerox 等高保真DNA 聚合酶用于PCR 擴增。
（3）連接時間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘。
（4）連接溫度：室溫 (22℃-37℃)，可使用PCR儀控溫。反應溫度為25℃。若片段有高GC等復雜結(jié)構(gòu)，可在37℃反應。
（5）產(chǎn)物要求：為保證PCR產(chǎn)物完整，建議72℃后延伸5-10分鐘。連接前使用瓊脂糖凝

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。