Annealing Buffer for DNA Oligos (10X)

保存條件：-20℃保存，一年有效。
產(chǎn)品介紹：
生產(chǎn)的 Annealing Buffer for DNA Oligos (10X)，即 DNA 寡核苷酸退火緩沖液，是一種經(jīng)過我們多次實驗證實、可以用
于 DNA oligo 退火的緩沖液。該退火緩沖液不僅可以用于常規(guī)的 DNA oligo 的退火，而且特別適合于較難退火的用于 RNAi(也稱
siRNA)質(zhì)粒構(gòu)建的 DNA oligo 的退火。用于 RNAi 質(zhì)粒構(gòu)建的 DNA oligo 通常由于含有約 20 個左右的互補序列，極易自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而影響兩條 DNA oligo 的正確退火。使用生產(chǎn)的 Annealing Buffer for DNA Oligos (10X)，可以有效避免 DNA oligo 自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且兩條 oligo 退火后可以直接和經(jīng)酶切、純化的質(zhì)粒連接。通常轉(zhuǎn)化后可以得到大量的陽性克隆。
使用本試劑盒操作非常簡單，只需把待退火的 DNA oligo 和 Annealing Buffer for DNA Oligos (10X)按照一定比例混合后，置于 PCR儀上，約 20 分鐘即可完成。
注意事項：
Annealing Buffer for DNA Oligos (10X) 只適合于 DNA oligo 的退火，不能用于 RNA oligo 的退火。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 把待退火的 DNA oligo 用經(jīng)滅菌的 Milli-Q 水或重蒸水配制成 50μM。溶解 Annealing Buffer for DNA Oligos (10X)，混勻備用。

2. 如下設(shè)置退火反應(yīng)體系：

按照上述順序依次加入各種試劑，混勻。如果所用的 PCR 儀沒有熱蓋，滴加礦物油(mineral oil)以防止蒸發(fā)。
3. 如下設(shè)置 PCR 儀進(jìn)行退火反應(yīng)：

注 1：如果條件有限，也可以將水浴鍋加熱至 95℃，把 PCR 管放在水浴鍋中，或者把煮沸的熱水加入到保溫杯或保溫瓶中，待水溫降到 95℃時放入 PCR 管。所用水量控制在 1-2 小時內(nèi)自然降溫至 25℃左右。此方法的退火效果可能會比使用 PCR 儀略差一些。
注 2：退火結(jié)束后可以直接用于連接反應(yīng)，也可以在-20℃凍存?zhèn)溆?。如果退火結(jié)束后打算進(jìn)行酶切等其它反應(yīng)，用純化試劑盒進(jìn)行純化，或者確保退火產(chǎn)物在反應(yīng)體系中體積不超過 5%，以避免 Annealing Buffer 對后續(xù)的酶反應(yīng)體系的干擾。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。