組織 / 細胞基因組 DNA 快速提取試劑盒

保存條件：本試劑盒在室溫儲存 12 個月不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹：
結(jié)合液/蛋白酶 K 迅速裂解細胞和滅活細胞內(nèi)核酸酶，然后基因組 DNA 在 高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的 步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖 液將純凈基因組 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
產(chǎn)品特點：
1.重復(fù)性好:離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280 典型的比值達 1.7～1.9，長度可達 30kb -50kb，可直接用于 PCR，Southern-blot 和各種酶切反應(yīng)。
注意事項：
1.結(jié)合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在 37℃水浴幾分 鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

 2.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。
 3.結(jié)合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫， 但應(yīng)該確保批 pH 大于 7.5，pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫 DNA 應(yīng)該保存在-20℃。 DNA 如果需要長期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時可以適當稀釋。
自備試劑：無水乙醇、1xPBS 緩沖液、RNase A（10mg/ml）（RNase A(10 mg/ml) 有售）。
操作步驟：
提示：次使用前請先在漂洗液 WB 中加入定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
如果需要去除 RNA，可在加蛋白酶 K 溶液前先加入 4μl RNaseA（10mg/ml）溶液振蕩 15sec，室溫放置 5 min

1.組織培養(yǎng)細胞
a. 收集約 105-10
6懸浮細胞到一個 1.5ml 離心管；對于貼壁細胞，應(yīng)該先用胰蛋白消化后吹打下來收集。
b. 12,000rpm 離心 10 sec，使細胞沉淀下來。棄上清，留下細胞團和大約 10-20μl殘留的液體。
c. 加 200μl 1×PBS 重懸洗滌細胞，12,000rpm 離心 10 sec，使細胞沉淀下來。棄上清, 將細胞沉淀重懸于 180μl 1XPBS 中。
d. 加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混勻（可選步驟：為清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振蕩混勻，可選擇室溫放置 5min），再加入 200μl結(jié)合液 CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在 70℃放置 10 min。
e. 冷卻后入 200μl 無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
f. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液。
g. 按操作步驟 4 繼續(xù)后續(xù)的實驗。
2.動植物組織（例如鼠肝腦或者植物葉片）
a. 新鮮或者解凍的組織在液氮中研磨成細粉后或者用解剖切成小碎塊（切成微塊可以提高產(chǎn)量）后取 20-50mg，轉(zhuǎn)入裝有 180μl 組織裂解液 TL 的 1.5ml 離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b. 加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c. 將裂解物放置在 55℃水浴 1-3 小時或者直到組織消化全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。為清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振蕩混勻（可選擇室溫放置 5 min）。
d. 加入 200μl 結(jié)合液 CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置 10 min。
e. 冷卻后加入 200μl 無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
f. 用 1ml 的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液。
g. 按操作步驟 4 繼續(xù)后續(xù)的實驗。
3.動物組織（鼠尾）
a.將 0.2-0.5cm 的鼠尾巴尖(即 20-50mg)剪碎（一定要剪 0-2cm 范圍內(nèi)的尾巴尖，否則裂解效果不好），或者在液氮中研磨組織成細粉后，轉(zhuǎn)入裝有 180μl 組織裂解液 TL 的 1.5ml 離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b.加入 20μl 的蛋白酶 K(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c.將裂解物放置在 55℃水浴 3 小時或者直到組織消化全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。為清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振蕩混勻（可選擇室溫放置 5 min）。
d.用一個 1ml 不帶針頭的一次性輸液抽打裂解物 2-3 次。
e.加入 200μl 結(jié)合液 CB 和 200μl 無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。
f.12,000rpm 離心 5 min，將上清加入一個吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液。
g.按操作步驟 4 繼續(xù)后續(xù)的實驗。
4.加入 500μl 抑制物去除液 IR，12,000rpm 離心 30 sec，棄廢液。
5.加入 500μl 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。
6.重復(fù)操作步驟 5。
7.將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
8. 取出吸附柱 AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 50-100 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置 3-5 min，12,000rpm 離心 1 min。為了增加基因組 DNA的得率，將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置 2 min，12,000rpm 離心 1 min。(注意: DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA降解。)

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。