鈣黃綠素 AM 是一種膜滲透性熒光酯酶底物，通常用于檢測細(xì)胞活性和質(zhì)膜完整性。作為一種近中性的底物，鈣黃綠素 AM 可以自由、無創(chuàng)地擴(kuò)散穿過質(zhì)膜并滲透到活細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，代謝活躍細(xì)胞中的胞質(zhì)酯酶會迅速將非熒光鈣黃綠素 AM 底物水解成鈣黃綠素產(chǎn)物，并由具有完整質(zhì)膜的細(xì)胞保留。由于死細(xì)胞缺乏酯酶活性，因此僅標(biāo)記活細(xì)胞。在藍(lán)光激發(fā)下，鈣黃綠素發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，與細(xì)胞酯酶的活性和樣品中存在的活細(xì)胞數(shù)量成正比。與其他活細(xì)胞標(biāo)記試劑（如 BCECF AM 或羧基熒光素二乙酸酯）相比，鈣黃綠素 AM 熒光更亮、光穩(wěn)定性更好，低細(xì)胞毒性有利于細(xì)胞追蹤、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性的研究。
 

      AAT Bioquest 提供多種可供選擇的用于細(xì)胞活力分析的鈣黃綠素 AM 產(chǎn)品。除了傳統(tǒng)的綠色熒光鈣黃綠素 AM 之外，我們還提供發(fā)出藍(lán)色、橙色、紅色和深紅色熒光的鈣黃綠素 AM 衍生物。

鈣黃綠素活性染料選擇指南

Calcein Blue AM, Calcein Orange™ Diacetate, Calcein Red™ AM, and Calcein Deep Red™ AM 用于多功能分析

Calcein AM ( 22004 ) 是細(xì)胞活星的主要指標(biāo)，它具有被動的細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散、低細(xì)胞毒性、出色的細(xì)胞保留以及在生理 pH 范圍內(nèi)的強(qiáng)熒光強(qiáng)度。因此，鈣黃綠素在 ~ 521 nm 處的熒光發(fā)射值使得與 GFP 轉(zhuǎn)染細(xì)胞或其他綠色熒光指示劑結(jié)合使用以進(jìn)行多重分析具有挑戰(zhàn)性。為了解決鈣黃綠素 AM 的單一顏色限制，AAT Bioquest 開發(fā)了具有多種顏色選擇的鈣黃綠素衍生物，包括鈣黃綠素藍(lán) AM、鈣黃綠素橙™ AM、鈣黃綠素紅™ AM 和鈣黃綠素深紅™ AM 染料，用于多色標(biāo)記和活細(xì)胞的功能分析（表 1）。
 

Calcein Blue AM

Calcein Blue AM (22007) 是一種 UV-light 可激發(fā)活性指示劑，可在 pH 4-11 下發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光 (Em = ~441)，專為與檢測藍(lán)色熒光的儀器一起使用。它可以與磷脂酰*氨酸染色劑Annexin V iFluor® 488 (20071) 和核酸死細(xì)胞染色劑7-AAD (17501) 結(jié)合使用，用于活/凋亡/壞死細(xì)胞群的三色區(qū)分（圖 1），如以及用于多色功能分析的 GFP、RFP 和其他綠色或紅色熒光探針。
 

Calcein Orange™ Diacetate

Calcein Orange™ diacetate (22007)   是藍(lán)/綠光可激發(fā)活力指示劑，可發(fā)出明亮的橙色熒光 (Em = ~545 nm)。與 calcein AM 一樣 .Calcein Orange™ diacetate 是一種非熒光透膜底物，需要酯酶水解才能激活其熒光，Calcein Orange™ 在質(zhì)膜未受損的活細(xì)胞中具有出色的細(xì)胞滯留性，使其成為一種有價值的細(xì)胞示蹤劑和活細(xì)胞標(biāo)記試劑。它可以與藍(lán)色或綠色熒光探針結(jié)合使用，例如 Hoechst 33342 (17535, 圖 2) 或者鈣指示劑 Cal-520^® AM (21130),
 

Calcein Red™ AM and Calcein Deep Red™ AM

 Calcein Red™ AM (21900) 和 Calcein Deep Red™ AM (22011). 在被胞質(zhì)酯酶水解后, Calcein Red™ (Ex/Em = 562/576 nm) 和Calcein Deep Red™ (Ex/Em = 643/663 nm) 被細(xì)胞膜完整保留并在對應(yīng)的光源激發(fā)下發(fā)出黃色或紅色熒光 ，Calcein Red™ AM 和 Calcein Deep Red™ AM 均可與藍(lán)色和綠色熒光探針結(jié)合使用

 

CytoCalcein™ Violet 450

=

Calcein Orange™ Diacetate

Calcein Deep Red™ AM

 用Calcein™ Blue AM (blue,22007), Annexin V iFluor® 488 (green, 20071), 和 7-AAD (red, 17501).;對 Staurosporine 處理的 Jurkat 細(xì)胞進(jìn)行染色；使用Calcein Orange™ diacetate (22007) 和 核酸染料Hoechst 33342 (17535).; 流式細(xì)胞術(shù)分析用2 µM Calcein Deep Red™ AM (22011, 紅色）染色的活 Jurkat 細(xì)胞和在 55°C 水浴中處理 30 分鐘的死細(xì)胞群（綠色）使用 NovoCyte 3000 流式細(xì)胞儀。 
 

表1.鈣黃綠素，AM特性

CytoCalcein™ Violet Viability 針對流式細(xì)胞術(shù)和成像進(jìn)行了優(yōu)化

CytoCalcein™ Violet 450 和 CytoCalcein™ Violet 500 針對流式細(xì)胞儀的使用進(jìn)行了優(yōu)化， 將非熒光 CytoCalcein™ Violet 450 AM 和 CytoCalcein™ Violet 500 AM 酶促轉(zhuǎn)化為高熒光 CytoCalcein™ Violet 450 和 CytoCalcein™ Violet 500 產(chǎn)品（Ex/Em maxima ~406/445 nm，在大多數(shù)流式細(xì)胞儀中都有發(fā)現(xiàn)。結(jié)合帶有紅色熒光核酸死細(xì)胞染料的碘化丙錠（PI，Ex/Em maxima ~537/618 nm）或 7-Aminoactinomycin D（7-AAD，Ex/Em ~549/648 nm），CytoCalcein™ Violet 染料是出色的熒光團(tuán)，用于膜完整性和酯酶活性對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行雙色區(qū)分。去除代表死細(xì)胞的數(shù)據(jù)點是提高流式細(xì)胞術(shù)分析準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟。

CytoCalcein™ Violet 450 和 CytoCalcein™ Violet 500 可作為 1 mg 單位規(guī)格的獨(dú)立試劑使用。此外，CytoCalcein™ Violet 450 在 Cell Meter™ 細(xì)胞活力檢測試劑盒中用作活力指示劑 *405 nm 激發(fā)的藍(lán)色熒光* (22784)。該試劑盒提供優(yōu)化的細(xì)胞標(biāo)記方案和充足的試劑，包括 CytoCalcein™ Violet 450、DMSO 和緩沖液，可使用 200 µL 分析體積和標(biāo)準(zhǔn)熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行 500 次測試。還可用于標(biāo)記活細(xì)胞，用于熒光流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞功能的顯微研究。

 

CytoCalcein™ Violet 450

CytoCalcein™ Violet 450 ( 22012 ) 的激發(fā)和發(fā)射光譜。
 

CytoCalcein™ Violet 500

 CytoCalcein™ Violet 500 ( 22013 ) 的激發(fā)和發(fā)射光譜

Table 2. 用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞鈣素AM活性染料的特性