Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒（熒光法）紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測NADP/NADPH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發(fā)現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應的還原能力。

傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 這些方法具有低靈敏度和高干擾，因為測定是在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內進行的。 基于吸收的NADP / NADPH測定的低靈敏度使得測定難以自動化以進行通常使用小樣品量的高通量篩選。

這種Amplite 熒光NADP / NADPH比率檢測試劑盒為敏感檢測NADP，NADPH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識別酶再循環(huán)反應中的NADP / NADPH，其顯著提高了檢測靈敏度。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在紅色可見范圍內運行，這顯著降低了樣品干擾。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行測定。 其信號可以通過熒光酶標儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（大Ex / Em = 540 / 590nm）或吸光度酶標儀在~576nm處容易地讀取。 這也提供NADP，NADPH提取緩沖液和細胞裂解緩沖液。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質的Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒。

實驗方案

96孔板檢測示例

概述

準備NADPH標準品或測試樣品（25μL）

在室溫下加入25μLNADPH或NADP提取液孵育15分鐘

加入25μLNADP或NADPH提取液（25μL）

加入NADP / NADPH反應混合物（75μL）孵育于 室溫保持15分鐘 -  2小時

監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強度

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作步驟

1.準備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH儲備溶液。

注意：未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.制備NADP / NADPH反應混合物：

將10mL NADPH傳感器緩沖液（組分B）加入NADP / NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：這種NADP / NADPH反應混合物足以用于兩個96孔板。未使用的NADP / NADPH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADPH標準品的連續(xù)稀釋液（0至10μM）：

3.1將10μL1mMNADPH儲備溶液（來自步驟1）加入990μLPBS緩沖液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADPH標準溶液。

注意：稀釋的NADPH標準溶液不穩(wěn)定，應在4小時內使用。

3.2取200μL10M NADPH標準溶液（來自步驟3.1）進行1：3連續(xù)稀釋，得到NADPH標準品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0 M系列稀釋液。

3.3如表1和2中所述，將含有NADPH標準品和含NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據需要準備細胞或組織樣本。為方便起見，NADP / NADPH裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細胞。

表1.實心黑色96孔微孔板中NADPH標準品和測試樣品的布局

注意：NS = NADP / NADPH標準; BL =空白對照; TS =測試樣品; TS（NADPH）=用NADPH提取液處理10至15分鐘的測試樣品，然后用NADP提取溶液中和; TS（NADP）=用NADP提取溶液處理10至15分鐘的測試樣品，然后用NADPH提取溶液中和。

表2每個孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標準品（0.01μM至3μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>100μM，終濃度）可能由于NADPH傳感器（對非熒光產物）的過度氧化而導致熒光信號降低。

3.4對于NADPH提?。∟ADPH）：將25μLNADPH提取溶液（組分D）加入含有NADP / NADPH的測試樣品的孔中。在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μL的NADP提取溶液（組分E）以中和NADPH提取物，如表1和2中所述。

對于NADP提?。∟ADP）：將25μLNAP提取溶液（組分E）加入含有NADP / NADPH的測試樣品的孔中。在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNADPH提取溶液（組分D）以中和NADP提取物，如表1和2中所述。

對于總NAPD和NADPH：將25μLNADP/ NADPH對照溶液（組分F）加入NADPH標準品的孔和含有NADP / NADPH的測試樣品中。在室溫下孵育10至15分鐘，然后如表1和2中所述添加25μL對照溶液（組分F）。

注意：根據需要準備細胞或組織樣本。 NADP / NADPH裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細胞。

4.在上清液反應中運行NADP / NADPH測定：

4.1將75μLNADPH反應混合物（來自步驟2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品（來自步驟3.4）的每個孔中，以使總NADPH測定體積為150μL/孔。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的熒光板讀數器監(jiān)測熒光增加。

注意：也可以將板的內容物轉移到白色透明底板上，并用吸光度酶標儀在576±5nm的波長下讀數。 與熒光讀數相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。