適用儀器

樣品實驗方案

簡要概述

1.用LacZ基因制備穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞
2.用測試化合物孵育細(xì)胞（樣品）
3.裂解細(xì)胞
4.將裂解液轉(zhuǎn)移至微量滴定板
5.添加β-Gal工作液
6.根據(jù)細(xì)胞類型，在室溫或37°C孵育至少10分鐘
7.添加停止反應(yīng)試劑
8.監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm的熒光強度

溶液制備

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 β-半乳糖苷酶底物儲備液（200X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到試鹵靈β-半乳糖苷酶（組分A）的小瓶中，制成200Xβ-半乳糖苷酶底物原液。 注意：25 µLβ-半乳糖苷酶底物儲備液足以容納1個板，避光。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液

β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品
可選（如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線）：用0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液制備一系列β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液。 將標(biāo)準(zhǔn)曲線上每個點的等分試樣50 µL轉(zhuǎn)移至平板的對照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推薦量為200 mU / mL（200-400 ng）。建議按1：3的比例稀釋由8個點組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 注意：調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線以適合特定的實驗條件，例如細(xì)胞類型，數(shù)量，轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)板的大小。 每次進行測定時，必須新鮮制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液。

3.工作溶液

1.1 0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液：
將30 µLβ-巰基乙醇（組分F）添加到10 mL反應(yīng)緩沖液（組分B）中，并充分混合。 注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 β-Gal工作液：
將25 µLβ-半乳糖苷酶底物儲備液（200X）加入5 mL的0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液中。 注意：β-Gal工作溶液足以用于一塊96孔板。

1.3 裂解緩沖液工作液：
使用前，將5 µLβ-巰基乙醇（組分F）加入5 mL裂解緩沖液（組分D）中。 注意：在裂解細(xì)胞之前，將0.1％β-巰基乙醇添加到裂解緩沖液中。

樣品操作及分析

表1.細(xì)胞培養(yǎng)板推薦的Lysis Buffer工作溶液體積

1.從哺乳動物細(xì)胞制備細(xì)胞提取物

1.1用測試化合物處理含有LacZ基因的細(xì)胞所需的時間。

1.2用1X PBS洗滌細(xì)胞兩次。不要移動細(xì)胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相應(yīng)地裂解細(xì)胞。

1.3.1對于貼壁細(xì)胞：將Lysis Buffer工作溶液添加至培養(yǎng)板。有關(guān)建議的數(shù)量，請參見表1。

1.3.2對于非貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞沉淀到離心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取決于細(xì)胞沉淀的大小）。

1.4將上一步的細(xì)胞在室溫下孵育10-15分鐘，然后輕輕旋轉(zhuǎn)平板或試管數(shù)次以確保裂解。

1.5繼續(xù)進行β-半乳糖苷酶測定，或?qū)悠吩?80°C下冷凍直至使用。注意：通過快速的凍融循環(huán)（在-20°C到-80°C冷凍1-2小時，然后在室溫解凍）也可以獲得良好的裂解?；蛘?，將細(xì)胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶物，然后測定上清液。

2.運行?-半乳糖苷酶測定

2.1如果需要，在室溫下解凍裂解細(xì)胞管或板。如果細(xì)胞接種在96孔板上，則直接在96孔板上進行測定。

2.2在96孔板的每個孔中加入50 µL細(xì)胞提取物。如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，請為標(biāo)準(zhǔn)曲線保存一些對照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率很高時，可在裂解緩沖液工作溶液中稀釋裂解液，或在轉(zhuǎn)染效率低時減少裂解液的體積。如果在96孔板上進行轉(zhuǎn)染，或?qū)⒎€(wěn)定的細(xì)胞系接種到96孔板上，請直接在板上進行測定。對于內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性控制，請?zhí)砑?0 µL非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。對于空白對照，添加50 µL Lysis Buffer工作溶液。

2.3向每個孔中加入50 µL的ResorufinβDG工作溶液。根據(jù)細(xì)胞類型，將板在室溫或37°C下孵育大約10分鐘至4小時。

2.4向每個孔中添加50 µL終止緩沖液（組分C）。

2.5使用吸光度酶標(biāo)儀測量在580 nm至460 nm（Ab580 / Ab460）波長下的OD比，監(jiān)測吸光度的增加。