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雙色熒光檢測試劑盒是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測細菌的試劑盒，AAT Bioquest的MycoLight™ Fluorescence Live/Dead Bacterial Imaging Kit提供雙色熒光檢測，通過熒光顯微鏡觀察活細菌和死細菌。MycoLight 520是一種非熒光酯酶底物，可擴散到革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中。在細菌細胞內(nèi)非特異性酯酶水解后，產(chǎn)生綠色熒光產(chǎn)物并在細菌內(nèi)積累。相比之下，碘化丙錠是一種紅色熒光核酸染色劑，只能穿透受損膜的細菌。因此，使用MycoLight 520和碘化丙錠染料的適當混合物，具有完整細胞膜的活細菌發(fā)出綠色熒光，而具有受損膜的死細菌產(chǎn)生紅色熒光。是一種用于對活/死細菌進行成像的強大工具?？梢栽贓x / Em = 488 / 525nm（FITC濾光器組）和540 / 620nm（TRITC濾光器組）下熒光測量染色細胞，分別用于活細菌和死細菌。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的雙色熒光檢測試劑盒 。

實驗方案

染色樣品示例

概述

1.準備100X MycoLight 520原液
2.準備細菌樣本
3.加入MycoLight 520和碘化丙錠
4.將細菌樣品與MycoLight 520和碘化丙啶在37°C孵育5-10分鐘或在室溫下孵育60分鐘
5.用FITC和TRITC濾光片組通過熒光顯微鏡分析樣品
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分

操作步驟

在沒有額外說明的情況下，所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.MycoLight 520原液（100X）：
將100μLDMSO（組分D）加入MycoLight 520（組分A）的小瓶中。
注意：將儲備溶液儲存在-20°C，避免光照，反復(fù)凍融。

2.制備濃度為106至108個細胞/ mL的細菌樣品。在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中將細菌培養(yǎng)到對數(shù)晚期。

注意：測量波長= 600 nm（OD600）的細菌培養(yǎng)物的光密度以確定細胞數(shù)。對于大腸桿菌培養(yǎng)物，OD 600 = 1.0等于8×108個細胞/ ml。

3.通過以10,000xg離心10分鐘除去培養(yǎng)基，并將沉淀重新懸浮在測定緩沖液（組分C）中。

4.通過用70％乙醇處理30分鐘，然后煮沸60分鐘，可以制備死細菌。

5.染色

以下是推薦的方案，應(yīng)根據(jù)不同的細菌菌株或其他特定需求進行優(yōu)化。如果觀察到更高的背景，可以在成像之前添加任選的洗滌步驟。

5.1將1μL100XMycoLight 520原液和1μL100X碘化丙啶（組分B）加入到100μL測定緩沖液中的細菌樣品中。
5.2充分混合并在37℃下在黑暗中孵育5-10分鐘或在室溫下孵育60分鐘以獲得佳染色結(jié)果。
5.3通過FITC（Ex / Em = 488 / 530nm）和TRITC（Ex / Em = 540 / 620nm）通道用熒光顯微鏡監(jiān)測細菌的熒光。

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