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酶底物法HJ1001-2018 標(biāo)準(zhǔn)版下載

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產(chǎn)品簡介

酶底物法檢測系統(tǒng)適用于地表水,地下水,生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群,糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定.本方法的檢出限為10MPN/L.

詳細(xì)介紹

水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法

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1、適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定。本方法的檢出限為10MPN/L。
2、規(guī)范性引用文件
本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T6682分析實驗用水規(guī)格和實驗方法
GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)
HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)
HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范
3、術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1
總大腸菌群totalcoliforms
37℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基的腸桿菌科細(xì)菌。
3.2
糞大腸菌群fecalcoliforms又稱耐熱大腸菌群（thermotolerantcoliforms）。44.5℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基的腸桿菌科細(xì)菌。
3.3
大腸埃希氏菌Escherichiacoli俗稱大腸桿菌。37℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基，同時產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）釋放出熒光物質(zhì)（4-甲基傘形酮）的腸桿菌科細(xì)菌。
3.4
可能數(shù)mostprobablenumber（MPN）又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計數(shù)法。利用統(tǒng)計學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量（單位體積存在目標(biāo)微生物的可能數(shù)）。
4、方法原理
在特定溫度下培養(yǎng)特定的時間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基（ONP）；大腸埃希氏菌同時又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，將選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計陽性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，查MPN表，分別計算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。
5、干擾和消除
5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入溶液（6.4）消除干擾。
5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.5）消除干擾。
6、試劑和材料
除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水應(yīng)滿足GB/T6682中三級水的要求。
6.1培養(yǎng)基。
本標(biāo)準(zhǔn)采用MinimalMediumONPG-MUG培養(yǎng)基。每100ml樣品需使用培養(yǎng)基粉末。
2.7g±0.5g，所含基本成分如下：
硫酸銨[(NH4)2SO4]0.5g
硫酸錳（MnSO4）0.05mg
硫酸鋅（ZnSO4）0.05mg
（MgSO4）10mg
氯化鈉（NaCl）1g
氯化鈣（CaCl2）5mg
亞硫酸鈉（Na2SO3）4mg
（AmphotericinB）0.1mg
鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）50mg
4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5mg
茄屬植物萃取物（Solanium萃取物）50mg
N-2--N-2-乙磺酸鈉鹽（HEPES鈉鹽）0.53g
N-2--N-2-乙磺酸（HEPES）0.69g
也可采用市售商品化培養(yǎng)基制品。
6.2（Na2S2O3·5H2O）。
6.3乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
6.4溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/ml。稱取15.7g（6.2），溶于適量水中，定容至100ml，臨用現(xiàn)配。
6.5乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15g/ml。稱取15g乙二胺四乙酸二鈉（6.3），溶于適量水中，定容至100ml，此溶液保質(zhì)期為30d。
6.697孔定量盤：含49個大孔，48個小孔。其中，每個小孔可容納0.186ml樣品，大孔中48個大孔每個可容納1.86ml樣品，一個頂部大孔可容納11ml樣品。也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。
6.7標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤。
6.8無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。
7、儀器和設(shè)備
7.1采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的100ml、250ml、500ml廣口玻璃瓶。
注：在采集不存在或不考慮余氧、金屬離子干擾的樣品時，可采用市售無菌采樣瓶或無菌采樣袋。
7.2高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。
7.3恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。
7.4程控定量封口機(jī)：用于97孔定量盤（6.6）的封口。
7.5紫外燈：365～366nm。
7.6移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。也可采用計量合格的可調(diào)式移液器。
7.7三角瓶：100ml。
7.8量筒：100ml±1ml。
7.9一般實驗室常用儀器和設(shè)備。
注：三角瓶、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗前按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸
汽滅菌20min，烘干，備用。
8、樣品
8.1樣品采集
點位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內(nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至，放水3～5min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對龍頭進(jìn)行消毒，開足龍頭，再放水1min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內(nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點進(jìn)行分層采樣時，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入溶液（6.4），以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用（每125ml容積加入0.1ml的溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.5），以消除干擾（每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。
注：15.7mg（6.2）可去除樣品中1.5mg活性氯，用量可根據(jù)樣品實際活性氯
量調(diào)整。
8.2樣品保存
采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。
9、分析步驟
9.1樣品稀釋

根據(jù)樣品污染程度確定接種量（見表1），避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤（6.6）出現(xiàn)全部陽性或全部陰性。接種量小于100ml時，應(yīng)稀釋樣品后接種，接種量為10ml時，取10ml樣品加入到盛有90ml無菌水（6.8）的三角瓶（7.7）中混勻制成1:10的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推。對于未知樣品，可選用多個接種量進(jìn)行檢測。

酶底物法檢測系統(tǒng)

9.2接種
量取100ml樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入2.7g±0.5g培養(yǎng)基（6.1）粉末，充分混勻，溶解后，全部倒入97孔定量盤（6.6）內(nèi)，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(jī)（7.4封口。觀察97孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤（6.7）的顏色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無菌水等一系列因素后，終止試驗或重新操作
注：9.1、9.2步驟在野外操作時應(yīng)避開明顯局部污染源，建議使用一次性手套、口罩、酒精燈等。
9.3培養(yǎng)
測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時，將封口后的97孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱（7.3）中37℃±1℃下培養(yǎng)24h。測定糞大腸菌群時，將封口后的97孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h。
9.4對照試驗
9.4.1空白對照
每次試驗都要用無菌水（6.8）按照步驟9.1～9.3進(jìn)行實驗室空白測定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。
9.4.2陰性和陽性對照
總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表2。

檢測指標(biāo)	陽性菌種	陰性菌種
總大腸菌群	大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）	（Staphylococcus aureus）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）
大腸埃希氏菌	大腸埃希氏菌	、假單胞菌屬
糞大腸菌群	大腸埃希氏菌（耐熱型）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella trevisan）（耐熱型）	產(chǎn)氣腸桿菌、糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）、假單胞菌屬

將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個/ml的菌懸液，將菌懸液按接種（9.2）和培養(yǎng)（9.3）要求操作，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)重新測定。
注：可先制備較高濃度菌懸液，采用在顯微鏡下對其濃度進(jìn)行初步測定，然后根據(jù)實際情
況用無菌水（6.8）稀釋至300～3000個/ml。
9.4.3結(jié)果判讀與計數(shù)
將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性；樣品變黃色且在紫外燈（7.5）照射下有藍(lán)色熒光，判斷為大腸埃希氏菌陽性。如果結(jié)果可疑，可延長培養(yǎng)至28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過28h后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果?？墒褂帽Ｙ|(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤以輔助判讀，參見附錄A。分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。

關(guān)鍵詞：高壓蒸汽滅菌器恒溫培養(yǎng)箱移液器玻璃器皿無菌包

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