由于RNA聚合酶一般由數(shù)個次單元組合而成，早先要在試管內(nèi)應(yīng)用RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性合成RNA并非易事，但這個問題在SP6, T3 及T7 等噬菌體的RNA聚合酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)以后，情況已*改觀。這主要是因?yàn)檫@類RNA聚合酶由一條多勝肽 （polypeptides） 所構(gòu)成，其在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時所須辨認(rèn)的啟動子長度僅20bp左右，而且轉(zhuǎn)錄起始位置非常明確，轉(zhuǎn)錄效能良好，成了目前進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時的*選擇。要進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，僅需將目標(biāo)基因次選殖 （subclone）至帶有SP6, T3 或T7 啟動子的轉(zhuǎn)錄載體，或者運(yùn)用PCR技術(shù)在基因的一端加上SP6, T3 或T7 啟動子的序列，即可運(yùn)用對應(yīng)的RNA聚合酶活性在試管內(nèi)合成正意股或反意股RNA。 以質(zhì)體DNA為模版進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前，應(yīng)先用限制酶自目標(biāo)基因的一端切開，以免轉(zhuǎn)錄反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行至載體的序列 （run-on），但在選擇限制酶切位時應(yīng)避免使用目標(biāo)基因也帶有的切位；限制酶內(nèi)切好的質(zhì)體DNA經(jīng)phenol/chloroform萃取的后，即可用來進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
儀器用具：微量離心機(jī)
藥品試劑： Plasmid DNA 酵解產(chǎn)物pBlueGus/HindIII 及pBlueGus/BamHI；5×Transcription buffer （200 mM Tris-Cl, pH 8.0; 40 mM MgCl2; 10 mM；spermidine-（HCl）3; 125 mM NaCl; Roche）NTPs （含ATP, CTP, GTP 及UTP 各2.5 mM）；RNase 抑制劑RNasin （40 U/μL）；T7 與T3 RNA polymerase （Roche）??；dH2O/DEPC；100 mM DTT （dithiothreitol）；DNase （RNase-free）
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1）, 以下簡稱PCI；Chloroform/isoamyl alcohol （24:1）, 以下簡稱CI