一、ELISA的基本原理
    酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顧名思義就是以酶作為標(biāo)記指示物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為
基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。因此，一個(gè)ELISA測(cè)定試劑，其有機(jī)組成部分包括三個(gè)方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物等?？乖蚩贵w的固相化并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標(biāo)記的抗體或抗原亦是如此，并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過(guò)程而喪失。整個(gè)測(cè)定中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則，顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強(qiáng)度與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應(yīng)來(lái)完成測(cè)定。
二、固相上抗原抗體相互作用的免疫化學(xué)
    通常所提到的抗原抗體的相互作用，一般指的是在液相狀態(tài)下，那么在固相狀態(tài)下，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)有什么樣的特點(diǎn)呢?本處作一簡(jiǎn)單介紹。
    1．固相上抗原抗體結(jié)合反應(yīng)所需要的時(shí)間  通常，固相免疫測(cè)定如ELISA中抗原抗體結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時(shí)間，要大于液相免疫測(cè)定，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當(dāng)在微孑L板孔內(nèi)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，界面反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示其對(duì)擴(kuò)散作用有很強(qiáng)的依賴性，擴(kuò)散性越強(qiáng)則反應(yīng)所需時(shí)間越短，結(jié)合越充分。這一點(diǎn)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)振蕩來(lái)達(dá)到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進(jìn)入到可與抗體或抗原包被界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放一個(gè)惰性的塞子以使反應(yīng)液體成為一個(gè)小體積，或使用一個(gè)具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來(lái)做到這一點(diǎn)。微顆粒小于lum時(shí)，在測(cè)定時(shí)即成膠體懸液，而當(dāng)顆粒或珠較大時(shí)，則會(huì)在沒(méi)有振蕩時(shí)，由于重力的作用而分開(kāi)。所有上述方法均是通過(guò)減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測(cè)定的擴(kuò)散依賴性。
    2．反應(yīng)體積  此處的反應(yīng)體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測(cè)定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測(cè)定，但比反應(yīng)管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應(yīng)發(fā)生于液體—固相界面，可能處于一級(jí)結(jié)合鍵的引力距離內(nèi)，小于10nm。液相中待測(cè)抗原或抗體要進(jìn)入到這個(gè)結(jié)合界面，需要擴(kuò)散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應(yīng)表面區(qū)域較微孑L要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應(yīng)體積的比例亦高得多。因此，結(jié)合反應(yīng)的效率更高。這也是全自動(dòng)化免疫測(cè)定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一?？蓞⑴c結(jié)合反應(yīng)的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應(yīng)體積，這無(wú)法計(jì)算。這一點(diǎn)使得使用通常的質(zhì)量作用定律圖形的Keq的計(jì)算變得復(fù)雜化，因此，固相抗原抗體反應(yīng)的KeQ值與液相抗原抗體反應(yīng)的Keq值沒(méi)有可比性。
    3．離解速率  界面包括細(xì)胞表面上的結(jié)合反應(yīng)的離解速率較液相中的要低兩個(gè)梯度，固相免疫測(cè)定中的緩慢的離解速率與細(xì)胞表面上發(fā)生的緩慢的離解速率的相似性很有意思，其原因如下：首先，細(xì)胞表面上的許多的相互作用涉及到細(xì)胞表面受體的聚集，由于多價(jià)復(fù)合物離解的減少，相應(yīng)地親和力增加。研究表明，被動(dòng)吸附于固相的抗原和抗體顯然也是成簇或聚集狀的，因此，反應(yīng)界面的抗原或抗體可能也是“成簇的”。其次，大多數(shù)抗原—抗體的離解所需的能量比防止其結(jié)合所需的能量要大，表明在初始結(jié)合鍵形成后，又形成了次級(jí)結(jié)合鍵。這提示在固相免疫測(cè)定和其他細(xì)胞表面反應(yīng)中，形成了大量的次級(jí)結(jié)合鍵。第三，很高的固相抗體或抗原濃度，尤其是以成簇出現(xiàn)的以及來(lái)自于限定的界面反應(yīng)體積的抗體或抗原，使得離解的抗原的重新結(jié)合較液相系統(tǒng)更為快速。這可以解釋為何固相免疫測(cè)定與液相測(cè)定相比時(shí)，其抗體的Keq較高。正是這種極緩慢的離解速率，使得ELISA和固相免疫測(cè)定技術(shù)具有很好的適用性，即使是測(cè)定的反復(fù)洗滌步驟，也不影響受體配體的相互作用，使之保持結(jié)合狀態(tài)。
    4．微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定  使用吸附的復(fù)雜抗原進(jìn)行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定，
與液相測(cè)定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體—配體相互作用的穩(wěn)定性似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測(cè)定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因?yàn)椋?br />    （1）有結(jié)合能力的抗原濃度極低。這可能是由于所吸附的抗原因?yàn)樽冃曰蚩臻g位阻而致
抗原表位喪失的結(jié)果。
    （2）抗原表位由于吸附發(fā)生改變，使得被其抗體結(jié)合部位以較低的親和力結(jié)合。當(dāng)抗原以l一5ug／m1濃度被動(dòng)吸附于固相時(shí)，大多數(shù)蛋白抗原的60%～80％至少會(huì)以一個(gè)單層而穩(wěn)定的吸附于固相，這樣在固相上的總的抗原就不會(huì)缺乏。如果500～800ng抗原穩(wěn)定的吸附于微孔板孔，對(duì)含500／~g／ml抗體的血清的1：10 000稀釋可提供大于10倍過(guò)量的抗原，考慮到相互作用的合理的Keq，吸附抗原的有限性不能解釋這個(gè)結(jié)果。因此，由于空間位阻或吸附引起的變性所致的抗原表位的喪失，似乎更有可能。
    5．固相的抗體或抗原  固相化的抗體或抗原可能與液相中的抗體或抗原所展示的構(gòu)型不一樣，對(duì)抗體或抗原由于固相化尤其是被動(dòng)吸附或其他吸附方式所致的構(gòu)型改變已有充分的認(rèn)識(shí)。