1. 流動(dòng)相的在線(xiàn)混合

所有的流動(dòng)相在線(xiàn)混合都是從方便出發(fā)的結(jié)果，流動(dòng)相混合的不充分是基線(xiàn)噪音的一個(gè)重要來(lái)源，混合方式主要兩種：

a. 低壓混合：采取時(shí)間脈沖的方式，利用比例閥，將不同流動(dòng)相按一定比例混合。

b. 高壓混合：利用多個(gè)泵頭，控制每個(gè)泵的流量，來(lái)將流動(dòng)相按一定比例混合。

在流動(dòng)相混合后，一般都有一個(gè)混合器(Mixer)，來(lái)幫助混合的更加充分。從流動(dòng)相開(kāi)始混合在一起，到流動(dòng)相到達(dá)色譜柱頭，這一段體積叫做延遲體積(Delay Volume)。 Mixer體積越大，混合越好，但是相應(yīng)延遲體積就越大，造成梯度的延遲。換句話(huà)說(shuō)，就是流動(dòng)相的變化，需要一定時(shí)間后，才能真正到達(dá)色譜柱，對(duì)分離產(chǎn)生影響。

a. 這個(gè)現(xiàn)象在使用UPLC或者UHPLC的時(shí)候，會(huì)有比較明顯的作用。

b. 為什么相同梯度方法，在不同儀器，或者不同品牌的儀器之間轉(zhuǎn)化時(shí)，保留時(shí)間可能不一樣？ 其主要原因就是延遲體積的不同。

在線(xiàn)混合很難做到非常均一的混合效果，這個(gè)在示差檢測(cè)器（RID）上的效果zui明顯。這也是為什么示差檢測(cè)器都要求將流動(dòng)相預(yù)混到一個(gè)瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何減小因?yàn)榛旌隙斐傻幕€(xiàn)噪音呢？

a. 對(duì)于等度的方法，非常簡(jiǎn)單，預(yù)混流動(dòng)相就可以了。

b. 對(duì)于梯度的方法，部分預(yù)混流動(dòng)相也會(huì)幫助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。
方法要求乙腈/水比例從10%走到85%。 那可以將流動(dòng)相A配成10%的乙腈，流動(dòng)相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度從0%走到100%。這就是部分預(yù)混。

c. 增大Mixer的體積。一般mixer的體積從幾百u(mài)l到幾個(gè)ml都有，在允許的延遲時(shí)間下，更換一個(gè)體積更大的Mixer，能夠有效提高混合的效率。每個(gè)se生產(chǎn)廠家的Mixer體積都不一樣，基本都可以混用。有碰到過(guò)一個(gè)Agilent的1100基線(xiàn)噪音大，后來(lái)?yè)Q成1050的mixer就好了，因?yàn)?050的mixer比較大一些。

2．液相硬件問(wèn)題造成的基線(xiàn)噪音

如果液相系統(tǒng)某些地方的工作不正常，也可能造成基線(xiàn)的噪音。

a. 系統(tǒng)有漏。特別是肉眼無(wú)法發(fā)現(xiàn)的微漏或者泵的內(nèi)漏，會(huì)造成流速的變化和混合比例的變化，從而導(dǎo)致基線(xiàn)噪音。檢查的方法就是對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行壓力測(cè)試：將系統(tǒng)從某個(gè)地方用死堵堵上，如泵出口，或者自動(dòng)進(jìn)樣器出口，將壓力升高到350bar后停泵，監(jiān)測(cè)壓力下降的情況。一般的標(biāo)準(zhǔn)是2-3bar/min的下降是正常水平?；蛘?5%/10min的下降。

b. 梯度比例問(wèn)題?？梢詫?duì)系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)梯度測(cè)試，來(lái)檢查梯度混合是否準(zhǔn)確和一致。將A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波長(zhǎng)下，將A的比例10%，20%，30%這樣一個(gè)一個(gè)的升高，每個(gè)比例走3min?？梢愿鶕?jù)計(jì)算，看每個(gè)基線(xiàn)臺(tái)階上升是否準(zhǔn)確。 也可以從0-100%走一個(gè)連續(xù)的梯度，看基線(xiàn)上升的平滑性和線(xiàn)性。

3．流動(dòng)相脫氣不好造成的基線(xiàn)噪音

對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，不僅僅是為了防止系統(tǒng)里面氣泡的產(chǎn)生。 流動(dòng)相脫氣越好，基線(xiàn)就會(huì)越好。如今zui常用的脫氣方式是在線(xiàn)脫氣機(jī)，但是有的時(shí)候脫氣并不*。所以當(dāng)有基線(xiàn)噪音問(wèn)題是，可以考慮采取多種的脫氣方式。

4．系統(tǒng)潔凈程度

前面1-3點(diǎn)講的都是內(nèi)在原因，造成的基線(xiàn)噪音或者波動(dòng)。如果你前面的原因都找過(guò)了，問(wèn)題還沒(méi)有解決，就得考慮一下是不是流動(dòng)相里面是否有雜質(zhì)了。如何檢查判斷是否為流動(dòng)相的問(wèn)題呢？

a. 每次更換一種流動(dòng)相，看基線(xiàn)結(jié)果。

b. 重新配置所有流動(dòng)相。這種方式比較快，但可能無(wú)法找到根本原因。

要特別注意在流動(dòng)相的配置過(guò)程中，是否引入了污染，比如使用了不干凈的玻璃器皿什么的。更換溶劑的品牌和批次也是方法之一。

色譜柱長(zhǎng)期使用造成的污染有時(shí)候也會(huì)造成基線(xiàn)波動(dòng)。有些時(shí)候樣品里面可能有些保留非常強(qiáng)的組分，可能在色譜柱上很長(zhǎng)時(shí)間才慢慢被沖出來(lái)，這時(shí)候已經(jīng)不是一個(gè)峰了，而是基線(xiàn)的干擾或者波動(dòng)了。

避免這種問(wèn)題的方法：在每批樣品后，用甲醇或者已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間沖洗色譜柱。另外，專(zhuān)柱也是一個(gè)好的習(xí)慣。如果一根se譜柱上作很多不同的樣品，也可能導(dǎo)致互相之間的污染和影響。

5．電路的噪音

對(duì)于UV檢測(cè)器來(lái)說(shuō)，就是采樣頻率不合適而產(chǎn)生的噪音?，F(xiàn)在隨著超液相的普及，檢測(cè)器的采樣頻率也越來(lái)越高，有的可以達(dá)到80Hz以上。但是如果一味追求高采樣頻率，可能對(duì)靈敏度沒(méi)有任何幫助，反倒產(chǎn)生比較大的噪音。(我們后面可能會(huì)有一起專(zhuān)門(mén)檢測(cè)器的時(shí)候，會(huì)更詳細(xì)的討論這個(gè)的原因)

一般來(lái)說(shuō)，我們需要保證一個(gè)se譜峰上面有15-20個(gè)點(diǎn)，來(lái)保證比較平滑的峰形和比較準(zhǔn)確的定量結(jié)果。如果我的一個(gè)峰的時(shí)間寬度是0.5min，就是是30s，那只要保證1Hz的采樣頻率就足夠了。如果在UPLC上面，一個(gè)峰的時(shí)間寬度是0.05min，也就是3s，就需要10Hz以上的采樣頻率。 那80Hz的采樣頻率什么時(shí)候用呢？ 你的一個(gè)峰只有0.5s的時(shí)候。

理論上的計(jì)算是這樣的
N=16（T/W）^2
N是柱效，T是保留時(shí)間，W是峰寬。

一般se譜如果柱效12000的塔板數(shù)。在5min的時(shí)候，出峰寬度大概計(jì)算出來(lái)時(shí)11s。你可以根據(jù)計(jì)算結(jié)果來(lái)調(diào)整檢測(cè)器的合適的采樣頻率。

上面從理論到實(shí)踐，從各個(gè)方面分析的液相色譜基線(xiàn)噪音或者波動(dòng)的來(lái)源，以及相應(yīng)排除問(wèn)題的方法，希望大家也能夠分享自己的經(jīng)驗(yàn)。

1. 流動(dòng)相的在線(xiàn)混合
所有的流動(dòng)相在線(xiàn)混合都是從方便出發(fā)的結(jié)果，流動(dòng)相混合的不充分是基線(xiàn)噪音的一個(gè)重要來(lái)源，混合方式主要兩種：

a. 低壓混合：采取時(shí)間脈沖的方式，利用比例閥，將不同流動(dòng)相按一定比例混合。

b. 高壓混合：利用多個(gè)泵頭，控制每個(gè)泵的流量，來(lái)將流動(dòng)相按一定比例混合。

在流動(dòng)相混合后，一般都有一個(gè)混合器(Mixer)，來(lái)幫助混合的更加充分。從流動(dòng)相開(kāi)始混合在一起，到流動(dòng)相到達(dá)色譜柱頭，這一段體積叫做延遲體積(Delay Volume)。 Mixer體積越大，混合越好，但是相應(yīng)延遲體積就越大，造成梯度的延遲。換句話(huà)說(shuō)，就是流動(dòng)相的變化，需要一定時(shí)間后，才能真正到達(dá)色譜柱，對(duì)分離產(chǎn)生影響。

a. 這個(gè)現(xiàn)象在使用UPLC或者UHPLC的時(shí)候，會(huì)有比較明顯的作用。

b. 為什么相同梯度方法，在不同儀器，或者不同品牌的儀器之間轉(zhuǎn)化時(shí)，保留時(shí)間可能不一樣？ 其主要原因就是延遲體積的不同。

在線(xiàn)混合很難做到非常均一的混合效果，這個(gè)在示差檢測(cè)器（RID）上的效果zui明顯。這也是為什么示差檢測(cè)器都要求將流動(dòng)相預(yù)混到一個(gè)瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何減小因?yàn)榛旌隙斐傻幕€(xiàn)噪音呢？

a. 對(duì)于等度的方法，非常簡(jiǎn)單，預(yù)混流動(dòng)相就可以了。

b. 對(duì)于梯度的方法，部分預(yù)混流動(dòng)相也會(huì)幫助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。
方法要求乙腈/水比例從10%走到85%。 那可以將流動(dòng)相A配成10%的乙腈，流動(dòng)相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度從0%走到100%。這就是部分預(yù)混。

c. 增大Mixer的體積。一般mixer的體積從幾百u(mài)l到幾個(gè)ml都有，在允許的延遲時(shí)間下，更換一個(gè)體積更大的Mixer，能夠有效提高混合的效率。每個(gè)色生產(chǎn)廠家的Mixer體積都不一樣，基本都可以混用。有碰到過(guò)一個(gè)Agilent的1100基線(xiàn)噪音大，后來(lái)?yè)Q成1050的mixer就好了，因?yàn)?050的mixer比較大一些。
2．液相硬件問(wèn)題造成的基線(xiàn)噪音
如果液相系統(tǒng)某些地方的工作不正常，也可能造成基線(xiàn)的噪音。

a. 系統(tǒng)有漏。特別是肉眼無(wú)法發(fā)現(xiàn)的微漏或者泵的內(nèi)漏，會(huì)造成流速的變化和混合比例的變化，從而導(dǎo)致基線(xiàn)噪音。檢查的方法就是對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行壓力測(cè)試：將系統(tǒng)從某個(gè)地方用死堵堵上，如泵出口，或者自動(dòng)進(jìn)樣器出口，將壓力升高到350bar后停泵，監(jiān)測(cè)壓力下降的情況。一般的標(biāo)準(zhǔn)是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b. 梯度比例問(wèn)題?？梢詫?duì)系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)梯度測(cè)試，來(lái)檢查梯度混合是否準(zhǔn)確和一致。將A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波長(zhǎng)下，將A的比例10%，20%，30%這樣一個(gè)一個(gè)的升高，每個(gè)比例走3min?？梢愿鶕?jù)計(jì)算，看每個(gè)基線(xiàn)臺(tái)階上升是否準(zhǔn)確。 也可以從0-100%走一個(gè)連續(xù)的梯度，看基線(xiàn)上升的平滑性和線(xiàn)性。
3．流動(dòng)相脫氣不好造成的基線(xiàn)噪音
對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，不僅僅是為了防止系統(tǒng)里面氣泡的產(chǎn)生。 流動(dòng)相脫氣越好，基線(xiàn)就會(huì)越好。如今zui常用的脫氣方式是在線(xiàn)脫氣機(jī)，但是有的時(shí)候脫氣并不*。所以當(dāng)有基線(xiàn)噪音問(wèn)題是，可以考慮采取多種的脫氣方式。
4．系統(tǒng)潔凈程度
前面1-3點(diǎn)講的都是內(nèi)在原因，造成的基線(xiàn)噪音或者波動(dòng)。如果你前面的原因都找過(guò)了，問(wèn)題還沒(méi)有解決，就得考慮一下是不是流動(dòng)相里面是否有雜質(zhì)了。如何檢查判斷是否為流動(dòng)相的問(wèn)題呢？

a. 每次更換一種流動(dòng)相，看基線(xiàn)結(jié)果。

b. 重新配置所有流動(dòng)相。這種方式比較快，但可能無(wú)法找到根本原因。

要特別注意在流動(dòng)相的配置過(guò)程中，是否引入了污染，比如使用了不干凈的玻璃器皿什么的。更換溶劑的品牌和批次也是方法之一。

色譜柱長(zhǎng)期使用造成的污染有時(shí)候也會(huì)造成基線(xiàn)波動(dòng)。有些時(shí)候樣品里面可能有些保留非常強(qiáng)的組分，可能在色譜柱上很長(zhǎng)時(shí)間才慢慢被沖出來(lái)，這時(shí)候已經(jīng)不是一個(gè)峰了，而是基線(xiàn)的干擾或者波動(dòng)了。

避免這種問(wèn)題的方法：在每批樣品后，用甲醇或者已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間沖洗色譜柱。另外，專(zhuān)柱也是一個(gè)好的習(xí)慣。如果一根色譜柱上作很多不同的樣品，也可能導(dǎo)致互相之間的污染和影響。
5．電路的噪音
對(duì)于UV檢測(cè)器來(lái)說(shuō)，就是采樣頻率不合適而產(chǎn)生的噪音?，F(xiàn)在隨著超液相的普及，檢測(cè)器的采樣頻率也越來(lái)越高，有的可以達(dá)到80Hz以上。但是如果一味追求高采樣頻率，可能對(duì)靈敏度沒(méi)有任何幫助，反倒產(chǎn)生比較大的噪音。(我們后面可能會(huì)有一起專(zhuān)門(mén)檢測(cè)器的時(shí)候，會(huì)更詳細(xì)的討論這個(gè)的原因)

一般來(lái)說(shuō)，我們需要保證一個(gè)se譜峰上面有15-20個(gè)點(diǎn)，來(lái)保證比較平滑的峰形和比較準(zhǔn)確的定量結(jié)果。如果我的一個(gè)峰的時(shí)間寬度是0.5min，就是是30s，那只要保證1Hz的采樣頻率就足夠了。如果在UPLC上面，一個(gè)峰的時(shí)間寬度是0.05min，也就是3s，就需要10Hz以上的采樣頻率。 那80Hz的采樣頻率什么時(shí)候用呢？ 你的一個(gè)峰只有0.5s的時(shí)候。

理論上的計(jì)算是這樣的
N=16（T/W）^2
N是柱效，T是保留時(shí)間，W是峰寬。

一般色譜如果柱效12000的塔板數(shù)。在5min的時(shí)候，出峰寬度大概計(jì)算出來(lái)時(shí)11s。你可以根據(jù)計(jì)算結(jié)果來(lái)調(diào)整檢測(cè)器的合適的采樣頻率。

上面從理論到實(shí)踐，從各個(gè)方面分析的液相色譜基線(xiàn)噪音或者波動(dòng)的來(lái)源，以及相應(yīng)排除問(wèn)題的方法，希望大家也能夠分享自己的經(jīng)驗(yàn)。