（2）CaCl₂濃度細(xì)胞活性的影響

在海藻酸鈉包埋固定化過(guò)程中，凝膠化劑CaCl₂中的Ca²⁺于海藻酸鈉根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細(xì)胞固定。CaCl₂溶液的濃度對(duì)固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度的影響見表四。

 

表四 CaCl₂濃度對(duì)固定化細(xì)胞凝膠機(jī)械強(qiáng)度的影響

 

隨著CaCl₂濃度的增加，微生物細(xì)胞的活性降低。當(dāng)CaCl₂濃度低于5%時(shí)，細(xì)胞活性可以保持在80%以上；但是當(dāng)CaCl₂濃度達(dá)到10%，細(xì)胞活性下降到60%左右，主要原因估計(jì)有兩種（i）由于鹽的滲析作用，引起細(xì)胞脫水，致使微生物活性部分喪失；（ii）在PCR技術(shù)中，CaCl₂是使細(xì)胞處于感受態(tài)的物質(zhì)，這個(gè)時(shí)候微生物是zui脆弱的，很容易被外界的干擾破壞。

從表四可以看出，CaCl₂濃度對(duì)固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度影響較大。當(dāng)CaCl₂濃度為2%~3%時(shí)，固定化顆粒在使用過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)膨脹，甚至出現(xiàn)裂縫活破碎現(xiàn)象。因此，海藻酸鈣包埋法固定化細(xì)胞活性較高。

3.2 PVA—H₃BO₃包埋法

3.2.1原理

*是一種新型的微生物包埋固定化載體，它具有機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)穩(wěn)定性好，康微生物分解性能強(qiáng)，對(duì)微生物無(wú)毒，價(jià)格低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，是一種具有實(shí)用潛力的包埋材料，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外獲得了較廣泛的研究。

*（polyvinyl alcohol，簡(jiǎn)稱PVA）的結(jié)構(gòu)為：

 

    *在加熱后溶于水，在其水溶液中加入添加劑后發(fā)生凝膠化，或者在低溫下（-10℃）冷凍形成凝膠，從而將微生物包埋固定在凝膠網(wǎng)絡(luò)里。常用添加劑有硼酸和硼砂，在PVA水溶液中加入硼酸活著硼砂，由于化學(xué)反應(yīng)而形成凝膠。PVA于硼酸反應(yīng)形成的凝膠為單二醇型，與硼砂反應(yīng)形成的凝膠為雙二醇型，其結(jié)構(gòu)式如圖1（略）。

 

PVA于硼砂反應(yīng)形成凝膠時(shí)，成形困難，凝膠呈海綿狀結(jié)構(gòu)，強(qiáng)度較低。但硼砂的用量較硼酸用量低得多，所以值的進(jìn)一步研究。就目前的研究來(lái)看，大多采用H₃BO₃做交聯(lián)劑。

PVA—H₃BO₃包埋法是一種制備容易且價(jià)格低廉的固定化方法，其反應(yīng)原理如圖2（略）。

利用該方法制得的凝膠顆粒機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長(zhǎng)且彈性好。

 3.2.2固定化方法

 以PVA為固定化載體，建立了利用PVA—H₃BO₃包埋固定化微生物細(xì)胞的方法，具體方法如下：

 方法I

①將*（PVA）加熱溶于水；

②將微生物細(xì)胞與PVA溶液混合均勻，使PVAzui終濃度為10%；

③將上述混合液滴入飽和的硼酸溶液中，放置10h，使其充分反應(yīng)；

④濾出固定化顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

方法II

①將*（PVA）加熱溶于水,冷卻；

②將微生物細(xì)胞與PVA溶液混合均勻，使PVAzui終濃度為10%；

③將PVA與微生物細(xì)胞的混合液到入已滅菌的培養(yǎng)皿中，緩慢加入飽和硼酸溶液，浸泡10h；

④將凝膠切成3mm×3mm×3mm的小方塊，用生理鹽水洗凈，備用。

方法III

①將*（PVA）與海藻酸鈉加熱溶于水,冷卻；

②將微生物細(xì)胞與上述溶液混合均勻，使PVA與海藻酸鈉zui終濃度分別為7.5％～10%，0.4%～1.0%；

③將上述混合液用針形管滴入下列溶液中：

 H₃BO₃（飽和溶液） CaCl₂ 1.0％～5.0％  pH值4.0～7.0

④放置10h，使之充分反應(yīng)；

⑤濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

利用上述固定化方法，包埋固定化黑曲酶，比較了固定化細(xì)胞的活性，結(jié)果如表五所示。

 

表五 PVA—H₃BO₃法固定化的比較

 

從表五可以看出，采用方法III，即改進(jìn)的PVA—H₃BO₃法固定化細(xì)胞，其活性明顯提高，這是由于在方法III的固定化過(guò)程中，引入了少量的海藻酸鈉。海藻酸鈉作為一種多糖類天然高分子化合物，對(duì)微生物細(xì)胞器一定的保護(hù)作用，減輕了硼酸對(duì)微生物的毒性作用，因此提高了固定化細(xì)胞的相對(duì)活性。

3.2.3 PVA—H₃BO₃法中固定化試劑對(duì)細(xì)胞活性的影響

（1）    PVA對(duì)細(xì)胞活性的影響

   一般來(lái)說(shuō)，PVA的濃度對(duì)微生物細(xì)胞活性的影響不大，即使高達(dá)10%時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性也沒有明顯的不良影響。但是，PVA濃度增大，溶液的黏度隨之增大，使底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，尤其是氧氣的傳遞受到影響，進(jìn)而影響細(xì)胞活性。

（2）    H₃BO₃對(duì)細(xì)胞活性的影響

   硼酸的細(xì)胞毒性比較大，因而其對(duì)微生物細(xì)胞活性的影響是導(dǎo)致PVA—H₃BO₃包埋固定化細(xì)胞活性底的主要原因。

4、固定化細(xì)胞性能的評(píng)價(jià)

4.1固定化顆粒的密度

固定化顆粒是指一定體積內(nèi)固定化顆粒的量， 因此，確定固定化顆粒的密度，也就是測(cè)定其體積和重量。但是由于固定化顆粒表面附著著一些水分，它不是固定化顆粒的組分，也無(wú)法通過(guò)過(guò)濾除去，可利用某些特殊溶劑（如葡萄糖）吸收，而這種溶劑不會(huì)擴(kuò)散到固定化顆粒內(nèi)，該溶劑被稀釋的量即為附著的水量。這樣，測(cè)定固定化顆粒的總量以及附著的水量即可通過(guò)計(jì)算的出其體積、密度和重量。具體方法此處不再詳細(xì)敘述。

4.2固定化顆粒的通透性和機(jī)械強(qiáng)度

    固定化顆粒的通透性，也稱為傳質(zhì)性能，是用來(lái)衡量的固定化細(xì)胞與外界交換能力的重要指標(biāo)。通透性越好，固定化細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換越容易，固定化微生物對(duì)于外界污染物的降解能力越強(qiáng)。

    機(jī)械強(qiáng)度，主要衡量固定化顆粒在外界的持續(xù)壓力沖擊下保持形狀的能力，一般來(lái)說(shuō)，機(jī)械強(qiáng)度越大，顆?？芍貜?fù)利用率越高，在工程上的應(yīng)用價(jià)值越大。

    但是，通透性和機(jī)械強(qiáng)度是一對(duì)矛盾。在固定化過(guò)程中，固定化時(shí)間越長(zhǎng)，顆粒的機(jī)械強(qiáng)度越大，但是通透性卻降低；反之，固定化時(shí)間越短，通透性提高，機(jī)械強(qiáng)度卻無(wú)法保證。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該綜合考慮兩個(gè)因素，在兩個(gè)指標(biāo)中尋找*的組合。

4.3固定化顆粒的zui適溫度、zui適pH值

    固定化后的顆粒，由于在存在狀態(tài)上與游離的微生物不同，因此在zui適溫度和zui適pH值方面也會(huì)有很大的不同?？梢酝ㄟ^(guò)做對(duì)照試驗(yàn)，測(cè)出不同組別在不同溫度和pH值的條件下降解速率，從而找出*的降解的溫度和pH值。

    同時(shí)可以看到，在固定化以后，微生物可以存在的溫度和pH值范圍比固定化以前有了顯著的擴(kuò)大。

4.4微生物的包埋量

    由于在制作固定化顆粒的過(guò)程中，不可避免的會(huì)有一部分微生物沒有包埋到顆粒之中，這部分微生物不會(huì)參加對(duì)污染物的降解，因而在一定程度上會(huì)影響降解的效果。 因此包埋量的測(cè)定也是評(píng)價(jià)固定化好壞的一個(gè)很重要的指標(biāo)。

    微生物的包埋量可以通過(guò)菌落技術(shù)的方法加以測(cè)定。

5、固定化微生物的發(fā)展趨勢(shì)

    微生物在自然界中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和環(huán)境凈化中起著非常重要的作用，微生物細(xì)胞是一個(gè)具有多種酶系統(tǒng)的統(tǒng)一體系，其本身就是一種天然的固定化酶反應(yīng)器，因此利用固定化方法將微生物具體細(xì)胞加以固定，則可以用于催化一系列生理生化反應(yīng)，固定化細(xì)胞內(nèi)的酶體系十分穩(wěn)定，且不影響其催化活性，具有造作和貯藏的良好穩(wěn)定性。隨著科學(xué)技術(shù)，尤其是生物工程以及工藝學(xué)的發(fā)展，開發(fā)應(yīng)用固定化技術(shù)處理廢水，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外專家、學(xué)者的重視，并且逐步實(shí)現(xiàn)其在工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。

    固定化細(xì)胞技術(shù)易其*的優(yōu)點(diǎn)在廢水生物處理領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，但是還有很多問(wèn)題亟待解決，未來(lái)的主要研究方向主要集中于以下幾點(diǎn)：

（1）    固定化載體類型以及包埋方式的研究；

（2）    尋找、廉價(jià)、抗毒性強(qiáng)的微生物；

（3）    開發(fā)多種生物共生的固定化載體；

（4）    開發(fā)具有良好流態(tài)的固定化反應(yīng)器；

（5）    協(xié)同固定化的研究。